Les phéochromocytomes (PCC) et les paragangliomes (PGL) sont des tumeurs neuroendocrines rares, pour lesquelles le déterminisme génétique est très important, avec 16 gènes de prédisposition identifiés à ce jour. Au cours de ce travail de thèse, je me suis plus particulièrement intéressée aux conséquences des mutations du gène SDHB, car il avait été préalablement démontré qu’elles constituaient un facteur de risque de mauvais pronostic, associé à un phénotype métastatique et à une réduction de la survie des patients. Grâce à l’analyse du transcriptome d’une large cohorte de 188 échantillons de PCC/PGL humains, j’ai pu mettre en évidence que la voie de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) était spécifiquement activée dans les tumeurs métastatiques SDHB-dépendantes. En effet, j’ai observé, dans ce sous-groupe de tumeurs, une surexpression de facteurs de transcription et de régulateurs précoces de l’EMT, comme TWIST1, TFC3, ou LOXL2 ; une perte d’expression de marqueurs de jonctions cellulaires, comme CDH2 et KRT19 ; ou encore une induction de gènes codant pour des enzymes pro-invasives, comme MMP1 et MMP2. Dans ces tumeurs, j’ai par ailleurs validé l’induction transcriptionnelle de l’EMT en mettant en évidence la rétention nucléaire de la protéine SNAIL (un facteur de transcription clé de l’EMT) sur des coupes de tissus. Dans cette même cohorte, l’analyse des données de méthylation globale de l’ADN nous a permis d’observer un phénotype hyperméthylateur dans les tumeurs SDHx, qui est expliqué par une inhibition de déméthylases de l’ADN et des histones par le succinate, qui s’accumule dans ces tumeurs où la succinate déshydrogénase est inactivée. Nous avons ainsi pu démontrer que le succinate est un oncométabolite qui induit des modifications épigénétiques impliquées dans l’extinction de nombreux gènes, et en particulier des gènes associés à l’EMT, comme le gène KRT19 (l’un des plus hyperméthylés dans les tumeurs SDHB-malignes, comparativement aux autres). J’ai ensuite caractérisé le premier modèle cellulaire de PCC/PGL porteur d’une inactivation complète du gène Sdhb, dans lequel j’ai confirmé l’activation de l’EMT, au niveau transcriptionnel et au niveau protéique. La caractérisation fonctionnelle de ces cellules m’a ensuite permis de mettre en évidence des propriétés migratoires, invasives, et adhésives spécifiques des cellules chromaffines Sdhb -/-. J’ai par la suite focalisé mon étude sur le gène Krt19, qui code pour une protéine du cytosquelette, la kératine 19 et qui est éteint dans les tumeurs et dans les cellules Sdhb -/-. La réintroduction de ce gène dans les cellules Sdhb -/- et son inhibition dans les cellules sauvages m’ont permis de conclure à l’implication de la kératine 19 dans les processus d’adhésion, de migration et d’invasion. Cependant je n’ai pas pu expliquer l’ensemble du phénotype par la seule modulation de ce gène, ce qui démontre l’implication d’autres acteurs dans la mise en place du phénotype invasif décrit. Mes travaux de thèse ont ainsi permis de démontrer que l’activation de l’EMT est responsable du caractère métastatique et invasif observé dans les tumeurs porteuses d'une mutation sur le gène SDHB et que cette activation est notamment secondaire aux modifications épigénétiques induites par l’inactivation de la succinate déshydrogénase. / Pheochromocytomas (PCC) and paragangliomas (PGL) are rare neuroendocrine tumors for which there is a major impact of genetic determinism with 16 identified predisposition genes to date. During this PhD training, I was particularly interested in the consequences of SDHB gene mutations because it was previously demonstrated that they constitute a high risk factor of poor prognosis, associated with metastatic phenotype and reduced survival. During my thesis, thanks to the analysis of transcriptomic data of a large cohort of 188 human PCC/PGL samples, I identified epithelial to mesenchymal transition (EMT) as activated in SDHB-metastatic tumors. Indeed, I observed a transcriptional induction of TWIST1, TCF3 and LOXL2, which are transcription factors or early regulators of EMT; a loss of expression of cellular junction components such as CDH2 and KRT19; and an up regulation of genes encoding pro-invasive proteases, such as MMP1 and MMP2. In these tumors, I validated the transcriptional induction of EMT by showing a nuclear retention of SNAIL protein, the master EMT transcription factor. In the same cohort, global DNA methylation data allowed us to describe a hypermethylator phenotype in SDHx related tumors, explained by the inhibition of DNA and histones déméthylases by succinate, which accumulates massively in cells inactivated for succinate dehydrogenase. We thus demonstrated that succinate is an oncometabolite responsible for epigenetic modifications implicated in gene extinction, including EMT-related genes such as KRT19 (one of the most hypermethylated genes in SDHB-metastatic samples). Following these observations, I characterized the first PCC/PGL cellular model displaying a complete Sdhb inactivation, in which I confirmed EMT activation, at transcriptional and protein levels. Functional characterization of these cells allowed me to show Sdhb-specific migratory, invasive and adhesive properties. I thus focused my study on Krt19, which encodes keratin 19, a cytoskeleton protein, lost in Sdhb -/- cells and in human SDHB-related tumors. Krt19 rescue in Sdhb -/- cells or Krt19 inhibition in wild-type cells allowed me to conclude that keratin 19 is implicated in adhesion, migration and invasion. However I was not able to explain the whole phenotype observed, demonstrating the implication of other actors in the establishment of the invasive phenotype. The main result of my PhD work is the discovery that EMT is a molecular pathway responsible for the metastatic and invasive phenotype observed in SDHB-mutated tumors as a result of epigenetic alterations due to succinate dehydrogenase inactivation.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-02-01T08:34:02Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle de Freitas Mizoguti - 2013.pdf: 1318732 bytes, checksum: 8084d20c2bec9e4264a71581ca4d04b2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-02-01T08:37:28Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle de Freitas Mizoguti - 2013.pdf: 1318732 bytes, checksum: 8084d20c2bec9e4264a71581ca4d04b2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-01T08:37:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Danielle de Freitas Mizoguti - 2013.pdf: 1318732 bytes, checksum: 8084d20c2bec9e4264a71581ca4d04b2 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Introduction: Leprosy Type 1 ( T1R) and type 2 reactions ( T2R) are considered the major complicators in the clinical management of leprosy patients. Leprosy reactions can occur before, during or after multidrug therapy (MDT). T1R is associated with exacerbated Th1 type cell mediated immunity (CMI) whereas T2R is associated with Th2 type immunity characterized by strong antibody production and in some cases transitory CMI to M. leprae antigens. Objective: Assess the serological reactivity to LID-1 fusion protein and to PGL-I M. leprae antigens among multibacillary (MB), paucibacillary (PB) leprosy patients that developed reaction at diagnosis or during MDT compared to reaction free MB and PB patients. Material and Methods: Paired serum samples from 73 leprosy patients were tested by ELISA to detect IgG antibodies to LID-1 and IgM responses to PGL-I. Leprosy patients included MB that developed T1R or T2R at diagnosis or during MDT and PB patients that developed T1R at diagnosis or during MDT compared to reaction free MB and PB patients. For T1R and T2R patients, samples collected during reactions and in the absence of reactions were tested and for reaction free patients samples collected at diagnosis and after MDT were tested. Results: The decline of anti LID-1 and anti PGL-I antibodies levels was significant among MB patients with T1R at diagnosis (p <0,05). Among MB patients with T2R at diagnosis and non reactional MB leprosy patients, the decline of antibodies was significant only to LID-1 (p <0,05). Higher levels of anti LID-1 antibodies were observed in MB patients who developed T2R at diagnosis compared with unreactional patients (p = 0.020) and patients who developed T1R at diagnosis (p = 0.008). Moreover, different antibody levels were seen in patients who developed T2R during MDT compared with unreactional MB patients after MDT (p = 0.020). Conclusions: Our data suggest that high anti LID-1 antibody levels may be associated with higher risk of T2R in MB patients. / Introdução: As reações hansênicas (tipo 1/RT1 e tipo 2/RT2) são as principais complicações no manejo clínico de pacientes com hanseníase e podem ocorrer antes, durante e após multidrogaterapia (MDT). A RT1 está associada a exacerbação da imunidade mediada por células (CMI) do tipo Th1 para antígenos do Mycobacterium leprae. Já a RT2 está associada com a resposta imunitária do tipo Th2, caracterizada por forte produção de anticorpos e em alguns casos ativação transitória da CMI. Objetivo: Avaliar a reatividade sorológica a proteína de fusão LID-1 e ao PGL-I do M. leprae em pacientes com hanseníase multibacilares (MB) e paucibacilares (PB) com reação hansênica e em pacientes MB e PB que não desenvolveram reação. Materiais e Métodos: Foram testadas amostras um total de 73 pacientes com hanseníase MB que desenvolveram RT1 ou RT2 ao diagnóstico ou durante MDT e em pacientes PB que desenvolveram RT1 ao diagnóstico ou durante MDT comparados com pacientes MB e PB que não desenvolveram reação hansênica ao diagnóstico nem durante MDT. A presença de IgG anti LID-1 e IgM anti PGL-I foi testada por ELISA. Resultados: O declínio dos níveis de anticorpos anti LID-1 e anti PGL-I foi significativo dentre os pacientes MB que estavam em RT1 ao diagnóstico (p< 0.05). Dentre os pacientes MB que estavam em RT2 ao diagnóstico e pacientes MB não reacionais, o declínio dos anticorpos foi significante apenas para LID-1 (p< 0.05). Níveis mais altos de anticorpos anti LID-1 foram observados nos pacientes MB que desenvolveram RT2 ao diagnóstico quando comparados com pacientes MB que desenvolveram RT1 ao diagnóstico (p=0.008) ou pacientes MB não reacionais (p=0.020). Pacientes MB que desenvolveram RT2 durante a MDT também apresentaram níveis mais altos de anticorpos anti LID-1 comparados com pacientes MB não reacionais após MDT (p=0.020). Conclusões: Nossos resultados sugerem que altos níveis de anticorpos anti LID-1 podem estar associados ao maior risco de desenvolvimento de RT2 em pacientes MB.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-10-05T14:30:57Z No. of bitstreams: 2 Dissertaçao - Adriano Badotti Grassi - 2007.pdf: 1439206 bytes, checksum: 031af098879a0122f9c34462d0323a5f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-10-05T14:31:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertaçao - Adriano Badotti Grassi - 2007.pdf: 1439206 bytes, checksum: 031af098879a0122f9c34462d0323a5f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-05T14:31:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertaçao - Adriano Badotti Grassi - 2007.pdf: 1439206 bytes, checksum: 031af098879a0122f9c34462d0323a5f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2008-02-25 / Objectives: This study compared two leprosy rapid tests detecting (1) IgM against PGL-I (ML-Flow test, KIT, Amsterdam, Netherlands) or (2) IgM, IgG and IgA against PGL-I (ML-ICA, Yonsei University, South Korea). Methods: Whole blood and serum from untreated multibacillary (MB; n=50) and paucibacillary (PB; n=48) leprosy patients (Reference Center for Diagnosis and Treatment, Goiania, central Brazil), MB household contacts (HHC; n=35) and healthy endemic controls (EC; n=50) were tested. Leprosy patients were classified by dermato-neurological evaluation, bacillary index (BI) and histopathology. Median age was 29 years, 39.9% males. MB patients had BB-BL-LL leprosy (median BI=2.0), PB patients had TT-BT leprosy. Results: (1) Using sera, ML Flow positivity of MB patients was comparable to ML-ICA positivity. (2) For ML-Flow tests, the positivity was comparable with whole blood and serum. (3) Among PB leprosy ML- flow positiviy was comparable for whole blood and serum but it was higher than the ML-ICA seropositivity in whole blood and serum. (4) Among MB leprosy patients positivity of ML Flow test in serum and whole blood was comparable to the positivity of ML-ICA in serum. Conclusion: ML-Flow test is more field applicable than ML-ICA since high positivity was observed among MB patients using whole-bood. / Objetivos: Este estudo comparou dois testes rápidos para hanseníase que detectam (1) IgM anti-PGL-I (ML-Flow test, KIT, Amsterdam, Holoanda) ou (2) IgM, IgG e IgA anti-PGL-I (ML-ICA, Yonsei University, Coréia do Sul). Materiais e Métodos: Foram testados sangue-total e soro de pacientes com hanseníase multibacilar (MB; n=50) e paucibacilar (PB; n=48), virgens de tratamento (Centro de Referência em Diagnóstica e Terapêutica, Goiânia, GO), contactantes intradomiciliares de MB (CD; n=35) e indivíduos saudáveis de área endêmica (CS; n=50). Pacientes com hanseníase foram classificados segundo avaliação dermato-neurológica, índice baciloscópico (IB) e exame histopatológico. A mediana da idade foi de 29 anos, 39.9% do sexo masculino. Pacientes MB apresentavam as formas BB-BL-LL (mediana do IB=2.0), Pacientes PB apresentavam as formas TT-BT. Resultados: (1) Para o grupo MB não observamos diferença significante entre os resultados dos testes ML-Flow em amostras de sangue-total e soro e os resultados do ML-ICA em amostras de soro; (2) Em todos os grupos (MB, PB, CD e CS) que não observamos diferença estatisticamente significativa entres os resultados do ML-Flow em sangue-total ou soro; (3) Entre os pacientes PB o ML-Flow apresentou sensibilidade significativamente maior que o teste ML-ICA, em amostras de sangue-total e em soro; (4) O teste ML-ICA em soro discriminou melhor os pacientes MB e PB. Conclusão: O teste ML-Flow mostrou-se melhor para utilização em situações de campo que o ML-ICA, pois apresentou alta reatividade em sangue-total em pacientes MB.

Submitted by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2015-03-26T20:31:18Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Brunela Pitanga Ramos Madureira.pdf: 595292 bytes, checksum: 91d4c514416e14264549113d0ff5dea1 (MD5) / Approved for entry into archive by Elizabete Silva (elizabete.silva@ufes.br) on 2015-04-09T19:24:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Brunela Pitanga Ramos Madureira.pdf: 595292 bytes, checksum: 91d4c514416e14264549113d0ff5dea1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-09T19:24:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Brunela Pitanga Ramos Madureira.pdf: 595292 bytes, checksum: 91d4c514416e14264549113d0ff5dea1 (MD5) Previous issue date: 2015-02 / Esse estudo investiga a infecção subclínica de Mycobacterium leprae em pacientes infectados e não infectados pelo HIV, através da dosagem de anticorpos anti-PGL-I, e avalia se existe uma possível correlação dos resultados sorológicos encontrados com o estado de imunossupressão dos pacientes infectados pelo HIV. Foi realizado um estudo transversal analítico em 350 pacientes infectados pelo HIV e em 350 pacientes não infectados pelo HIV para detecção de anticorpos IgM anti-PGL-I em região endêmica para hanseníase. Avaliou-se uma possível correlação do estado de imunossupressão dos pacientes infectados pelo HIV (contagem de linfócitos CD4+, carga viral e uso ou não de terapia antirretroviral) com a soropositividade para PGLI. Dentre os pacientes infectados pelo HIV, 6% (21/350) apresentaram sorologia positiva para PGL-I e dos indivíduos não infectados pelo HIV, 29,1% (102/350) tinham PGL-I positivo. O grupo controle apresentou cerca de cinco vezes mais indivíduos com anticorpos anti-PGL-I do que o grupo infectado pelo HIV. Não houve diferença estatisticamente significativa na correlação do estado de imunossupressão do paciente com o resultado da sorologia anti-PGL-I. Houve uma menor produção de anticorpos anti-PGL-I em indivíduos infectados pelo HIV, o que pode indicar uma baixa taxa de infecção subclínica por M. leprae, ou uma baixa produtividade específica desses anticorpos, ou ambas as hipóteses. A desregulação de linfócitos B em indivíduos infectados pelo HIV pode ser a causa da baixa produção de anticorpos anti-PGL-I. Não houve correlação do estado de imunossupressão do paciente com o resultado da sorologia anti-PGL-I. / The present study investigated subclinical Mycobacterium leprae infection in human immunodeficiency virus (HIV) infected or uninfected individuals by measuring antibodies against M. leprae phenolic glycolipid I (PGL-I). It also sought to establish whether the serology results correlated with the HIV-infected participants’ state of immunosuppression. This was a cross-sectional study that analysed the anti-PGL-I immunoglobulin M antibody levels in 350 HIV-infected and 350 non-HIV-infected individuals residing in an area endemic for the two investigated conditions. The possible correlation between the state of immunosuppression of the HIV-infected participants (CD4+ cell count, viral load and the use or not of antiretroviral therapy) and anti-PGL-I seropositivity was assessed. Approximately 6% (21/350) of the HIVinfected and 29.1% (102/350) of the non-HIV-infected participants were anti-PGL-I antibody seropositive. The number of anti-PGL-I antibody seropositive individuals was approximately five-fold higher in the non-HIV-infected group, compared with the HIV-infected group. There was no significant correlation between the state of immunosuppression of the HIV-infected participants and the anti-PGL-I serology results. The HIV-infected individuals exhibited less anti-PGL-I antibody production relative to the control group, which may indicate a lower rate of subclinical M. leprae infection and/or lower specific production of this antibody. B cell dysregulation might cause the low anti-PGL-I antibody production in HIV-infected individuals. The patients’ state of immunosuppression did not correlate with the anti-PGL-I serology results.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER I: Leprosy presents a clinical spectrum that spans from a strong cellular mediated immunity and bacili growth control of Mycobacterium leprae at the tuberculoid pole to a poor T cell immunity with extensive bacterial load at the lepromatous pole. The antigenic profile characterization in both clinical forms is a necessary step for discover and evaluation of recombinant peptides that are mimotopes of M. leprae antigens, which may present immunogenic potential, in order to obtain a beTer understanding of the disease evolution, and allowing the improvement of diagnosis, prognosis and therapeutics. Mimotopes of M. leprae antigens were selected from a random heptapeptide conformational library expressed in fusion with the pIII protein of the M13 phage, using as the ligand target the total purified IgM from leprosy patients of clinical forms, tuberculoid (TT) and lepromatous (LL), and a healthy control population. Recombinant peptides were selected by glycine elution (unspecific) and by mitsudin elution (specific). All clones, after bioinformatic analyses, were validated by immunoenzymatic and colony reduction assays. For the glycine selection, the TT pole presented 24 distinct fagotypes, while the LL pole presented only 14 fagotypes. For the mitsudin selection, only 4 fagotypes were obtained in the LL pole, and 8 fagotypes in the TT pole. The two most frequent mimotopes, in both TT and LL poles and in both elution protocols, were coincidents. The peptides LFPAMHQ and VERHPST were more frequent in the LL pole, and the peptides KNPTTGT and ETHPTTR were more frequent in the TT pole. The three cited first mimotopes had an accentuated plaque reduction with incubation of sera from LL patients; however, the mimotope ETHPTTR presented the highest reduction with sera from TT patients. The immunogenic potential of these mimotopes may be useful in the development of new diagnostic and therapeutic strategies for leprosy control in the future. CHAPTER II: The phenolic glycolipid 1 (PGL-1) is a membrane antigen highly specific of M. leprae, and it is not found in other mycobacteria. Serological tests with PGL-1 have been performed to detect circulating antibodies in multibacillary patients. Due to its importance in the clinical classification of leprosy patients, we have developed mimotopes of this non-proteic antigen through phage display in order to improve serological assays. In this investigation, a random heptapetide conformational library was selected to obtain specific ligands to the monoclonal antibody anti-PGL-1 CS-48. After three rounds of selection, 14 clones were sequenced and translated, generating six distinct peptides. The mimotope HWMLPED was the most frequent one (57%), suggesting an immunodominance. Serological tests with this mimotope were performed in comparison to the synthetic PGL-1 for 39 patients, classified according to their clinical form, together with their 44 household contacts, classified according to their index cases. Results were similar for T and LL patients. However, the intermediate forms were variable, differently from those results with PGL-1, which presented positivity only for multibacillary patients. The clinical form BT presented a seropositivity of 55.5% for the mimotope against 0% for the PGL-1, probably due the greater avidity of the mimotope to circulating antibodies, or due to the greater spepcificity of the peptide in detecting pure neural reaction, or yet a cross reaction with other human antibodies. The serological tests of household contacts for this same phage clone presented an average positivity of 20.5% versus an average of 7.5 for the PGL-1 antigen. It is probable that there was cross reaction of the mimotope with other antibodies; once it presented partial identity with other M. leprae proteins. The mimotopes must be further investigated, once they may be putative targets for the PGL-1 action in the immune humoral response, and also they could be useful in diagnostics and therapeutic strategies. / CAPITULO I: A hanseníase apresenta um espectro clínico que varia de uma forte resposta imune mediada por células e controle do crescimento do bacilo Mycobacterium leprae no pólo tuberculóide (T), a uma anergia em resposta celular, com alta carga bacteriana, no pólo virchoviano (V). A caracterização do perfil antigênico do bacilo nas formas clínicas se faz necessária para que novos peptídeos recombinantes, mimotopos de antígenos de M. leprae, sejam avaliados quanto ao seu potencial imunogênico, para que se tenha um melhor entendimento dos mecanismos de evolução da doença, e para permitir o aprimoramento do diagnóstico, prognóstico e terapêutica. Mimotopos de antígenos de M. leprae foram selecionados a partir de uma biblioteca conformacional de heptapeptídeos randômicos expressos em fusão com proteína pIII de fagos M13, utilizando como alvo ligante IgM total purificada de pacientes portadores de hanseníase de ambos os pólos, tuberculóide e virchoviano, e de contatos intradomiciliares sadios. Os peptídeos recombinantes foram selecionados por eluição em tampão glicina (inespecífico) e por eluição com mitsudina (específico). Todos os clones, após análises de bioinformática, foram validados por ensaios imunoenzimáticos e alguns por ensaios de redução de colônias. Na eluição com glicina, o pólo tuberculóide apresentou 24 fagótopos distintos, enquanto que o virchoviano apresentou 14. Já na eluição com mitsudina, foram obtidos apenas 4 fagótopos para pólo virchoviano e 8 para o pólo tuberculóide. Os dois mimotopos mais freqüentes, em ambas as formas clínicas e para as duas eluições foram coincidentes, sendo que os peptídeos LFPAMHQ e VERHPST foram os mais freqüentes no pólo virchoviano e os peptídeos KNPTTGT e ETHPTTR os mais freqüentes no pólo tuberculóide. Os três primeiros peptídeos, dos quatro acima citados, tiveram redução de colônias mais acentuada com soro de pacientes V, e o mimotopo ETHPTTR foi o que apresentou a maior redução com soro de pacientes T. O potencial imunogênico destes mimotopos pode ser útil no desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas para o controle da hanseníase. CAPITULO II: O Glicolipídeo Fenólico-1 (PGL-1) é um antígeno de membrana altamente específico de M. leprae, não sendo encontrado em outras micobactérias. Os testes sorológicos com o PGL-1 têm sido implementados para a detecção de anticorpos circulantes nas formas clínicas multibacilares. Por ser um alvo importante na classificação clínica dos pacientes, procurou-se desenvolver peptídicos miméticos deste antígeno não-protéico por phage display, como forma de aprimorar o teste sorológico. Neste estudo uma biblioteca conformacional de heptapeptídeos randômicos foi selecionada para obtenção de ligantes específicos ao anticorpo monoclonal anti-PGL-1 CS-48. Após 3 ciclos de seleção, 13 clones foram seqüenciados e traduzidos, gerando seis mimotopos distintos. O mimotopo HWMLPED foi o mais freqüente (61,5%), indicando ser imundominante entre os peptídeos. Testes sorológicos com este mimotopo foram realizados em comparação com o PGL-1 sintético para 37 pacientes, classificados conforme a forma clínica, juntamente com seus 44 contatos, classificados conforme seus casos índice. Os resultados obtidos com o mimotopo e PGL-1 foram similares nos pacientes com as formas clínicas polares T e V. Contudo, as formas intermediárias dimorfas foram altamente variáveis e significantes, diferentemente do PGL-1, que apresentou positividade somente para as formas multibacilares. A forma clínica DT, apresentou 55,5% de positividade com a utilização do fagótopo, contra 0% para o PGL-1, podendo ser uma maior avidez do fagótopo ao anticorpo circulante, ou maior especificidade do fagótopo para lesão neural pura, como também reação cruzada com outros anticorpos. O teste sorológico em contatos intradomiciliares para o fagótopo selecionado, apresentou uma média de 20,5% de positividade contra uma média de 7,5% no teste sorológico para o PGL-1. É provável que tenha ocorrido reação cruzada do mimotopo por este apresentar identidade parcial com proteínas do M. leprae. Os mimotopos devem ser analisados mais profundamente, pois podem indicar provável alvo de ação do PGL-1 na resposta imune humoral e ainda podem ser usados em estratégias diagnósticas e terapêuticas. / Doutor em Genética e Bioquímica

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2018-08-21T12:03:55Z No. of bitstreams: 1 angelicadaconceicaooliveiracoelho.pdf: 3773705 bytes, checksum: e753f755e09e6a5c7102c48ac076e08f (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-08-21T14:22:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 angelicadaconceicaooliveiracoelho.pdf: 3773705 bytes, checksum: e753f755e09e6a5c7102c48ac076e08f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-21T14:22:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 angelicadaconceicaooliveiracoelho.pdf: 3773705 bytes, checksum: e753f755e09e6a5c7102c48ac076e08f (MD5) Previous issue date: 2015-08-14 / PROQUALI (UFJF) / A infecção subclínica pode ser avaliada por meio de teste sorológico, que determina imunoglobulinas circulantes. O objetivo do presente estudo foi analisar a reatividade de diferentes antígenos em casos novos de hanseníase, contatos domiciliares de casos e em população de área endêmica, com o intuíto de identificar o melhor antígeno para o diagnóstico sorológico da hanseníase e detecção de indivíduos infectados pelo Mycobacterium leprae. Trata-se de um estudo transversal de natureza exploratória e analítica. A reatividade anti-LID1, NDO-LID, NDO-HSA e PGL-1 foi avaliada por meio do enzyme-linked immunosorbent assay. Foram analisadas amostras de sangue total em papel de filtro Whatman de 2494 indivíduos da população de sete municípios da microrregião de Almenara e de soro de 94 casos novos de hanseníase e 104 contatos domiciliares de casos residentes no município de Uberlândia. O Banco de Dados foi criado no Software Epi Info versão 3.5.1 e análise realizada no software Statistical Package for the Social Sciences for Windows 18 e no GraphPad Prism versão 5. Para análise estatística foram utilizados os seguintes testes: Kolmogorov-Smirnov, Kruskal-Wallis one-way (H), Mann-Whitney (U) com correção de Bonferroni, kappa, Spearman (rho), teste Qui-quadrado de Pearson e regressão logística binária. Foi observado maior soropositividade no grupo de casos multibacilares (MB), em contatos domiciliares de casos MB e nos indivíduos residentes nos municípios de Almenara e Jequitinhonha. Obteve-se correlação positiva entre a sorologia e o índice baciloscópico, concordância substancial e significativa no grupo de casos novos de hanseníase e correlação positiva para todos os antígenos testados. Os testes anti-LID-1 e anti-NDO-LID apresentaram melhor performance para identificar os contatos domiciliares e ou indivíduos da população infectados pelo M. leprae. O PGL-1 nativo teve maior positividade do que o NDO-HSA para todas as formas clínicas da hanseníase e no grupo de contatos domiciliares. A prevalência de soropositividade na população foi superior à taxa de detecção de casos de hanseníase em todos os municípios avaliados. A faixa etária, a renda familiar, residir em município endêmico, conhecer alguém que teve ou tem hanseníase, ter ou ter tido caso de hanseníase na familia e residir ou ter residido com caso de hanseníase são fatores que podem explicar a diferença de soropositividade anti-NDO-LID. Apenas a faixa etária e conhecer alguém que teve ou tem hanseníase é capaz de explicar a diferença de soropositividade anti-NDO-HSA. E em relação ao LID-1 nenhuma variável foi explicativa. Todos os antígenos analisados podem auxiliar na diferenciação e caracterização da hanseníase MB e na identificação de indivíduos expostos ao M. leprae, porém o NDO-LID apresentou melhor performance na identificação desses indivíduos e dos casos paucibacilares, quando comparado aos testes envolvendo os antígenos LID-1 e NDO-HSA separadamente, portanto fornece benefício adicional a esses antígenos e poderia ser utilizado como ferramenta auxiliar na vigilância epidemiológica da hanseníase. / The subclinical infection can be evaluated by serologic test which determine circulating immunoglobulins. The aim of this study was to analyze the reactivity of different antigens in leprosy cases, household contacts of index cases and the population of the endemic area to identify the best antigen for the diagnosis of leprosy and detection of individuals infected with Mycobacterium leprae. It is a cross-sectional study of exploratory and analytical nature. The reactivity anti-LID-1, NDO-LID, NDO-HAS e PGL-1 were evaluated using the enzymelinked immunosorbent assay. The whole blood in Whatman filter paper of 2494 individuals from the general population of seven municipalities in the micro-Almenara and serum of 94 patients with leprosy and 104 household contacts of patients residing in Uberlândia were analyzed. The database was created in Epi Info software version 3.5.1 and analysis in the software Statistical Package for Social Sciences for Windows 18 and GraphPad Prism version 5. For statistical analysis the following tests were used: Kolmogorov-Smirnov, Kruskal Wallis one-way (H), Mann-Whitney (U) with Bonferroni correction, kappa, Spearman (rho), chisquare test of Pearson and binary logistic regression. Identied higher seropositivity in the group of MB patients, household contacts of MB patients and in individuals living in the municipalities of Almenara and Jequitinhonha. Observed positive correlation between serology test and bacterial index, substantial agreement and significant in patients positive and positive correlation for all antigens. The LID-1 and NDO-LID antigens showed greater ability to identify household contacts or the general population infected with M. leprae, but the performance of the NDO-LID was better. The native PGL-1 had higher seropositivity than the NDO-HSA for all clinical forms of leprosy and household contacts. The seropositivity prevalence in the general population was higher than the detection rate of leprosy cases in all evaluated municipalities. The age, family income, living in a city endemic, knowing someone who had or has leprosy, had or have the case in the family and live or lived with leprosy case are factors that can explain the anti-NDO-LID seropositivity difference. Only the age range and know someone who had or has leprosy is able to explain the anti-NDO-HSA seropositivity difference. And for the LID-1 no variable explained the anti-LID-1 seropositivity difference. All serological tests analyzed can assist in the differentiation and characterization of MB leprosy and the identification of individuals exposed to M. leprae, but NDO-LID performed better in identifying these individuals and PB patients, when compared to the tests involving the LID-1 and NDO-HSA antigens separately, therefore provides additional benefit to these antigens and could be used as an auxiliary tool in epidemiological surveillance of leprosy.

CHAPTER II: Objective: Our aim was to compare the performance of three serological assays in leprosy patients and their household contacts utilizing two quantitative ELISA tests using native PGL-I (PGL-1 ELISA), synthetic ND-O-HSA (ND-O-HSA ELISA), and the semi-quantitative lateral flow test (ML-Flow). Methods: Compare the performance of three immunological assays, PGL-I ELISA, ND-O-HSA ELISA, and ML-Flow were evaluated in 156 leprosy patients and 191 household contacts. Results: The sensitivity results of the PGL-1, ND-O-HSA, and ML-Flow were 68.83%, 63.65%, and 60.65%, respectively. The native and synthetic PGL-I ELISA assays detected antibodies in 22.73%, 31.82% of the paucibacillary (PB) patients, and the ML Flow test did not detect antibodies in this group. The ML-Flow test was able to discriminate patients into PB and multibacillary (MB) forms, while the native PGL-I and ND-O-HSA correlated with the bacillary load and the Ridley-Jopling clinical forms. In household contacts, the native PGL-I, ND-O-HSA, and ML-Flow assays detected seropositivity of 25%, 17%, and 10%, respectively. Conclusions: The use of ELISA and ML-Flow tests are thus recommended as additional tools in the diagnosis and classification of the clinical forms, aiding in prescribing the correct treatment regimen to prevent subsequent nerve damage and disability. CHAPTER III: Host pathogen interactions are mainly mediated by specialized molecules of the cell envelope. One of these essential mycobacterial cell wall components is the lipoarabinomannan (LAM). LAM has immunomodulatory roles, but its heterogeneity may be responsible for the differential immune response in leprosy patients and contacts. The research to structural motifs that could contribute as virulence factors and/or protective epitopes, and thereby derive effective biomarkers for diagnosis, drugs and/ or vaccines against leprosy has been very developed. Therefore, our aim was to develop specific mimetic peptides to this lipoglycan by using Phage Display of a random heptamer peptide library that may recognize a differential response in patients and contacts. We have used the anti-LAM CS-35 monoclonal antibody as a target for three rounds of selection. After sequencing and translation, peptides were pre-validated by ELISA and compared to the synthetic LAM-BSA antigen. The most reactive and repetitive peptide motif (A9) was subsequently tested against serum from 54 leprosy patients and 27 endemic controls by ELISA. The A9 phage-displayed peptide clone presented high levels of IgG antibodies in paucibacillary patients, from which 50% of them presented highly reactive sera. This reactivity has also been detected in tuberculoid, borderline-borderline and lepromatous patients. High levels of IgG1 were most frequent in endemic controls and reactional patients. On the other hand, the IgG profile and its subclasses in patients presented high levels of IgG and IgG2 and low levels of IgG1. The A9 clone presented a significant correlation with the synthetic LAM-BSA, for the IgG1 response. The highly reactive IgG response against the A9 clone was associated with the tuberculoid clinical form diagnosis, and detection of both IgG1 and IgG3 against this clone was associated with protection in endemic controls. CHAPTER IV: Heat Shock Proteins (HSPs), GroES and GroEL, are targets of strong human T-cell response, and a third of the cells responsive to M. leprae, recognize these proteins. Monoclonal antibodies mAbs CS-01 and CS-44 selected mimetic peptides that are ligands of their Fab portions, by phage display technique. Sera from 54 patients, 48 household contacts and 27 endemic controls were submitted to ELISA with B2 and A1 mimetic clones of the GroES and GroEL proteins, respectively, for detection of IgG and its subclasses. Using the mimetic clone of B2 GroES, the ELISA detected IgG antibodies present in sera of patients, contacts and endemic controls. The IgG antibodies were abundant in sera from multibacillary patients, especially in lepromatous (LL). A decline of IgG1 was found in patients and household contacts that became sick with leprosy and a raise of this subclass was present in sera of household contacts that did not develop the disease. With the mimetic clone of GroEL A1, the reactive antibodies were abundant in multibacillary patients, with a correlation with the bacillary load. In this study we observed that IgG antibodies against GroEL and GroES can be detected in the diagnosis of leprosy in serological tests produced with clones mimetics of these proteins. And the subclasses of IgG antibodies to GroES can demonstrate a targeting of antigenic molecules that induce the production of protective antibodies. / CAPÍTULO III: Objetivo: O objetivo do trabalho foi comparar a performance de três testes sorológicos em pacientes e seus contatos domiciliares utilizando dois testes quantitativos ELISA, um com o antígeno PGL-1 nativo (ELISA PGL-1), com o antígeno ND-O-HSA sintético (ELISA ND-O-HSA), e o teste semi-quantitativo do fluxo lateral (ML-FLow). Métodos: Os três testes imunológicos ELISA PGL-I, ELISA ND-O-HSA, e ML-Flow foram realizados utilizando soros de 156 pacientes com hanseníase e 191 contatos domiciliares. Resultados: Os resultados da sensibilidade dos testes ELISA PGL-1, ND-O-HSA e ML-FLow foram de 68.83%, 63.65%, e 60.65%, respectivamente. Os testes ELISA PGL-1 nativo e sintético detectaram anticorpos em 22,73% e 31,82% dos soros de pacientes paucibacilares (PB),e o teste ML-FLow não apresentou reatividade em nenhum soro. O ML-Flow foi capaz de discriminar entre os pacientes com as formas PB e multibacilares (MB), enquanto que o ELISA PGL-1 e ND-O-HSA correlacionaram com a carga bacilar e as formas clínicas de Ridley-Jopling. Em contatos domiciliares, os testes ELISA PGL-1 nativo, ND-O-HSA e Ml-FLow detectaram soropositividade de 25%, 17%, e 10%, respectivamente. Conclusões: O uso do teste ELISA e ML-Flow são recomendados no diagnóstico e classificação das formas clínicas, auxiliando na prescrição do tratamento correto e na prevenção do dano neural e da incapacidade. CAPÍTULO IV: Interação patógeno-hospedeiro é mediada principalmente por moléculas especializadas do envelope celular. Um dos componentes essenciais da parede celular das micobactérias é a lipoarabinomanana (LAM). A LAM tem um papel imunomodulador, mas a sua heterogeneidade pode ser responsável pela resposta imune diferenciada em pacientes com hanseníase e contatos. Espera-se que a pesquisa por motivos estruturais de M. leprae possam contribuir, como fatores de virulência ou epítopos de proteção, e assim, derivar biomarcadores eficazes para o diagnóstico, drogas e vacinas contra a hanseníase. Portanto, nosso objetivo foi desenvolver peptídeos miméticos específicos à LAM utilizando Phage Display de uma biblioteca aleatória de peptídeos heptameros que possam reconhecer uma resposta diferencial em pacientes com hanseníase e contatos. Nós utilizamos o anticorpo monoclonal anti-LAM, CS-35, como um alvo de três rodadas de seleção. Após seqüenciamento e tradução, os peptídeos foram pré-validados por ELISA e comparados com o antígeno sintético LAM-BSA. O motivo peptídeo mais reativo e repetitivo (A9) foi posteriormente testado contra o soro de 54 pacientes com hanseníase e 27 controles endêmicos por ELISA. O clone mimético A9 apresentou altos níveis de anticorpos IgG em pacientes paucibacibacilares (PB), sendo que 50% destes soros foram altamente reativos. Esta reação também ocorreu em pacientes tuberculóides, dimorfo-dimorfo e virchowiano. Controles endêmicos e pacientes reacionais apresentaram altos níveis de IgG1 no soro. Por outro lado, o perfil de IgG e suas subclasses em pacientes apresentou altos níveis de IgG e IgG2 e baixos níveis de IgG1. O clone A9 apresentou uma correlação positiva significativa com o antígeno LAM-BSA sintético para a resposta IgG1. A resposta de IgG altamente reativa contra o clone A9 foi associada com o diagnóstico da forma clínica tuberculóide, e a detecção de ambos, IgG1 e IgG3, contra esse clone foi associado à proteção nos controles endêmicos. CAPÍTULO V: Interação patógeno-hospedeiro é mediada principalmente por moléculas especializadas do envelope celular. Um dos componentes essenciais da parede celular das micobactérias é a lipoarabinomanana (LAM). A LAM tem um papel imunomodulador, mas a sua heterogeneidade pode ser responsável pela resposta imune diferenciada em pacientes com hanseníase e contatos. Espera-se que a pesquisa por motivos estruturais de M. leprae possam contribuir, como fatores de virulência ou epítopos de proteção, e assim, derivar biomarcadores eficazes para o diagnóstico, drogas e vacinas contra a hanseníase. Portanto, nosso objetivo foi desenvolver peptídeos miméticos específicos à LAM utilizando Phage Display de uma biblioteca aleatória de peptídeos heptameros que possam reconhecer uma resposta diferencial em pacientes com hanseníase e contatos. Nós utilizamos o anticorpo monoclonal anti-LAM, CS-35, como um alvo de três rodadas de seleção. Após seqüenciamento e tradução, os peptídeos foram pré-validados por ELISA e comparados com o antígeno sintético LAM-BSA. O motivo peptídeo mais reativo e repetitivo (A9) foi posteriormente testado contra o soro de 54 pacientes com hanseníase e 27 controles endêmicos por ELISA. O clone mimético A9 apresentou altos níveis de anticorpos IgG em pacientes paucibacibacilares (PB), sendo que 50% destes soros foram altamente reativos. Esta reação também ocorreu em pacientes tuberculóides, dimorfo-dimorfo e virchowiano. Controles endêmicos e pacientes reacionais apresentaram altos níveis de IgG1 no soro. Por outro lado, o perfil de IgG e suas subclasses em pacientes apresentou altos níveis de IgG e IgG2 e baixos níveis de IgG1. O clone A9 apresentou uma correlação positiva significativa com o antígeno LAM-BSA sintético para a resposta IgG1. A resposta de IgG altamente reativa contra o clone A9 foi associada com o diagnóstico da forma clínica tuberculóide, e a detecção de ambos, IgG1 e IgG3, contra esse clone foi associado à proteção nos controles endêmicos. / Doutor em Genética e Bioquímica

Les phéochromocytomes (PCC) et les paragangliomes (PGL) sont des tumeurs neuroendocrines rares, pour lesquelles le déterminisme génétique est très important, avec 16 gènes de prédisposition identifiés à ce jour. Au cours de ce travail de thèse, je me suis plus particulièrement intéressée aux conséquences des mutations du gène SDHB, car il avait été préalablement démontré qu'elles constituaient un facteur de risque de mauvais pronostic, associé à un phénotype métastatique et à une réduction de la survie des patients. Grâce à l'analyse du transcriptome d'une large cohorte de 188 échantillons de PCC/PGL humains, j'ai pu mettre en évidence que la voie de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) était spécifiquement activée dans les tumeurs métastatiques SDHB-dépendantes. En effet, j'ai observé, dans ce sous-groupe de tumeurs, une surexpression de facteurs de transcription et de régulateurs précoces de l'EMT, comme TWIST1, TFC3, ou LOXL2 ; une perte d'expression de marqueurs de jonctions cellulaires, comme CDH2 et KRT19 ; ou encore une induction de gènes codant pour des enzymes pro-invasives, comme MMP1 et MMP2. Dans ces tumeurs, j'ai par ailleurs validé l'induction transcriptionnelle de l'EMT en mettant en évidence la rétention nucléaire de la protéine SNAIL (un facteur de transcription clé de l'EMT) sur des coupes de tissus. Dans cette même cohorte, l'analyse des données de méthylation globale de l'ADN nous a permis d'observer un phénotype hyperméthylateur dans les tumeurs SDHx, qui est expliqué par une inhibition de déméthylases de l'ADN et des histones par le succinate, qui s'accumule dans ces tumeurs où la succinate déshydrogénase est inactivée. Nous avons ainsi pu démontrer que le succinate est un oncométabolite qui induit des modifications épigénétiques impliquées dans l'extinction de nombreux gènes, et en particulier des gènes associés à l'EMT, comme le gène KRT19 (l'un des plus hyperméthylés dans les tumeurs SDHB-malignes, comparativement aux autres). J'ai ensuite caractérisé le premier modèle cellulaire de PCC/PGL porteur d'une inactivation complète du gène Sdhb, dans lequel j'ai confirmé l'activation de l'EMT, au niveau transcriptionnel et au niveau protéique. La caractérisation fonctionnelle de ces cellules m'a ensuite permis de mettre en évidence des propriétés migratoires, invasives, et adhésives spécifiques des cellules chromaffines Sdhb -/-. J'ai par la suite focalisé mon étude sur le gène Krt19, qui code pour une protéine du cytosquelette, la kératine 19 et qui est éteint dans les tumeurs et dans les cellules Sdhb -/-. La réintroduction de ce gène dans les cellules Sdhb -/- et son inhibition dans les cellules sauvages m'ont permis de conclure à l'implication de la kératine 19 dans les processus d'adhésion, de migration et d'invasion. Cependant je n'ai pas pu expliquer l'ensemble du phénotype par la seule modulation de ce gène, ce qui démontre l'implication d'autres acteurs dans la mise en place du phénotype invasif décrit. Mes travaux de thèse ont ainsi permis de démontrer que l'activation de l'EMT est responsable du caractère métastatique et invasif observé dans les tumeurs porteuses d'une mutation sur le gène SDHB et que cette activation est notamment secondaire aux modifications épigénétiques induites par l'inactivation de la succinate déshydrogénase.

Introdução: As reações hansênicas caracterizam-se por eventos imunológicos agudos que ocorrem antes, durante ou após a Poliquimioterapia da hanseníase, sendo desencadeadas principalmente pela interação entre os antígenos do Mycobaterium leprae, PGL-1 e LAM, com os componentes da imunidade do hospedeiro, TLR1 e TLR2, que consequentemente induzem outras células a sintetizar citocinas que favorecem o controle ou disseminação bacilar. Objetivos: Estabelecer e quantificar as relações causais entre os antígenos de M. leprae (PGL-1 e LAM) e os receptores TLR1, TLR2 e seus efeitos na expressão de citocinas IFN-γ e IL-10 nas reações hansênicas. Material e métodos: Por meio da sorologia ELISA foi possível dosar os níveis de IgM anti-PGL-1 e IgG anti-LAM e com emprego da RT-qPCR procedeu-se a análise da expressão gênica de TLR1, TLR2, IFN-γ e IL-10 utilizando amostras do sangue de 17 pacientes com reação hansênica e 17 sem reação (caso-controle) que posteriormente foram subdivididos em 4 grupos. Na comparação entre as médias das variáveis nos diferentes grupos, utilizou-se a análise de variância (ANOVA) e na avaliação do grau de associação entre as principais variáveis, a matriz de correlação de Pearson. Ao final, elaborou-se a análise de trilha para verificar relações causais envolvendo os antígenos e receptores do tipo Toll tendo como efeitos direto e indireto a expressão de citocinas. Resultados: Do total de 34 pacientes, 76,4% (26/34) eram MB e 23,6% PB, sendo que 100% (17/17) dos casos reacionais eram MB e dos controles 53% (9/17). Analisando o grupo reacional, 41,2% (7/17) apresentaram reação tipo 1, enquanto que 58,8% (10/17) tiveram reação tipo 2, destacando que na reação tipo 1, 57,1% (4/7) dos pacientes tiveram reação antes do tratamento (downgrading), 14,2% (1/7) durante e 28,8% (2/7) após PQT. Na reação tipo 2, todos desenvolveram reação após alta. Os níveis de anti-PGl-1 estiveram elevados na reação tipo 1 e na reação tipo 2, com diferença significativa entre as médias desses grupos quando comparados aos controles PB (F=6,42; p=0,002). Em relação ao anti-LAM, esse esteve associado a reação do tipo 2, grupo cujas médias foram mais elevadas, e apresentaram diferenças significativas quando comparado aos demais grupos (F=15,27; p<0,001). Os grupos reacionais expressaram maiores níveis de mRNA de IL-10 (F=3,99; p=0,023), enquanto que o grupo controle expressou mais IFN-γ, especialmente aqueles PB (F=5,30; p=0,008). Não houve diferenças nos níveis de expressão de TLR1 e TLR2 nos diferentes grupos. No grupo reacional, a análise de trilha quantificou os efeitos diretos de anti-LAM (0,623) e anti-PGL-1 (0,605) sobre TLR2, maiores que o efeito residual desse modelo (0,255), indicando que esses marcadores antigênicos influenciaram somente a expressão de TLR2, que consequentemente associou-se a IL-10 nesse grupo. Um mecanismo oposto ocorreu no grupo controle, visto que, constatou-se uma via imunológica que regulou a expressão de IFN-γ dependente da associação entre TLR1-TLR2. Conclusão: Em conclusão, a análise de trilha permitiu demonstrar a relação causal entre antígenos, TLR2 e IL-10 nas reações hansênicas, que podem sofrer influência de falha no mecanismo de associação entre TLR1 e TLR2, objeto de futuras investigações. / Background: The leprosy reactions are acute immunological events that occur before, during or after MDT of leprosy, being triggered mainly by interaction between the antigens of Mycobacterium leprae, PGL-1 and LAM, with the components of immunity of the host, such as, TLR1 and TLR2, that induce cells to produce cytokines related to control or bacillary dissemination. Objectives: The main goal of this research is establish causal relations between antigens of M. leprae (PGL-1 and LAM) and receptors, TLR1, TLR2 and their effects on cytokines expression, IFN-γ and IL-10, in leprosy reactions. Methods: Through ELISA serology it was possible measure the levels of anti-PGL-1 IgM and anti-LAM IgG, and with the use of the RT-qPCR proceeded the analysis of gene expression of TLR1 TLR2, IFN-γ and IL-10 using blood samples from 17 reactional patients and 17 nonreactional patients (Case-control study) that posteriorly were subdivided into 4 groups. For comparison between means of the variables, it resorted to use of analysis of variance (ANOVA) and about the degree of association between the variables, it has applied the correlation matrix. At the end, it was used the path analysis to verify the causal relation evolving antigens and toll-like receptors, whose the direct and indirect effects were the cytokines expression. Results: Among 34 patients, 76.4% (26/34) were MB and 23.6% PB, being that 100% (17/17) of reactional cases were MB and among the controls 53% (9/17). Analyzing the reactional group, 41.2% (7/17) suffered type 1 reaction, while 58.8% (10/17) presented type 2 reaction, emphasizing that, among patients with type 1 reaction, 57.1% (4/7) had reaction before treatment (downgrading), 14.2% (1/7) during and 28.8% (2/7) after MDT, whereas all patients of the type 2 reaction group, developed this occurrence after treatment. The levels of anti-PGl-1 have been elevated in type 1 and type 2 reactions with significant differences between means of these groups when compared to PB controls (F=6.42; p=0.002). Regarding to anti-LAM, this has been associated to type 2 reaction, group whose the means were higher than others, and this data showed significant differences as well (F=15.27; p<0.001). The reactional groups expressed higher levels of IL-10 (F=3.99; p=0,023), whereas the control group produced high levels of IFN-γ, especially the PB control (F=5.30; p=0.008). There were no differences in the levels of TLR1 and TLR2 expression in the comparison among groups. In the reactional group, the path analysis quantified the direct effects of anti-LAM (0.623) e anti-PGL-1 (0.605) on TLR2, which were higher than the residual effect of this model (0.255), indicating that these antigenic markers influenced only the TLR2 expression, which consequently correlated with the IL-10 expression in this group. An opposing mechanism occurred in the control group, insofar as it was found an immunological pathway that regulated the IFN-γ expression dependent on TLR1 and TLR2 association. Conclusion: In conclusion, path analysis allowed to demonstrate the causal relation between TLR2 and IL-10 in leprosy reactions that may suffer influence of failure in the mechanism of association between TLR1 and TLR2, as such occurs in TLR2 polymorphisms, object of future investigations. / Tese (Doutorado)

<p>DNA methylation is an epigenetic modification that is nearly ubiquitous. Eukaryotic DNA methylation contributes to the regulation of gene expression and maintaining genome integrity. In mammals, DNA methylation occurs primarily on the C5 carbon of cytosine in a CpG dinucleotide context and is catalyzed by the DNA methyltransferases, DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. While <i>dnmt3a</i> and <i>dnmt3b</i> genes are highly homologous, the enzymes have distinct functions. Some previous reports suggested differences in the enzymatic behavior of DNMT3A and 3B, which could affect their biological roles. The goal of my thesis work was to characterize kinetics mechanisms of DNMT3A and 3B, and to identify the similarities and differences in their catalytic properties that contribute to their distinct biological functions. Given the sequence similarity between the enzymes, we asked whether DNMT3B was kinetically similar to DNMT3A. In a series of experiments designed to distinguish between various kinetics mechanisms, we reported that unlike DNMT3A, DNMT3B methylated tandem CpG on DNA in a processive manner. We also reported that the disruption of the R-D interface, critical for the cooperativity of DNMT3A, had no effect on DNMT3B activity, supporting the non-cooperative mechanism of this enzyme. </p> <p>DNMT3A is frequently mutated in numerous cancers. Acute Myeloid Leukemia (AML) is a malignancy of hematopoietic stem cells in which numerous patients exhibit a high frequency of the heterozygous somatic mutation Arg882His in DNMT3A. Through thorough consensus motif building, we discovered a strong similarity in CpG flanking sequence preference between DNMT3A Arg882His variant and DNMT3B enzyme. Moreover, we found that the variant enzyme has the same kinetics mechanism as DNMT3B, indicating a gain-of-function effect caused by the mutation. This change is significant because the variant enzyme can aberrantly methylate DNMT3B targets in AML cells and effect global gene expression. In particular, given that DNMT3B has been shown to have oncogenic properties, this suggests that the Arg882His variant can acquire similar oncogenic properties and drive AML development.</p> <p>Taken together, my thesis work provides novel insights into the relationship between the biochemical properties and the biological functions of DNMT3A and 3B. </p>