Le recours aux cellules souches pour améliorer la réparation et guérison des blessures et maladies musculosquelettiques chez le cheval est de plus en plus fréquent. Les développements récents dans la reprogrammation cellulaire ont permis le développement de nouvelles sources de cellules souches pour ces thérapies régénératives. Des cellules souches pluripotentes induites (iPS) autologues peuvent être dérivées de cellules adultes par la reprogrammation directe à travers l'expression induite des gènes de pluripotence. Le clonage par transfert nucléaire (SCNT) suivi de la dérivation de cellules souches embryonnaires (ES) permet la reprogrammation indirecte des cellules adultes. Cependant, l’efficacité de ces deux méthodes pour la dérivation de cellules pluripotentes génétiquement stables est faible. Nous avons donc combiné les techniques SCNT et iPS dans le but de développer un protocole efficace de dérivation de cellules iPS autologues à partir de fibroblastes de la peau équine. Quatre facteurs de reprogrammation ont été introduits dans les cellules fibroblastes de fœtus clonés (ntFF) ainsi que les cellules ES provenant d’embryons clonés (ntES) pour induire leur reprogrammation en cellules iPS autologues. Les cellules ntFF-iPS et ntES-iPS ont des capacités prolifératives avancées et expriment des marqueurs de pluripotence importants. Par contre, les cellules ntES ont une efficacité de reprogrammation significativement supérieure aux cellules nt-FF et forment des colonies trois fois plus rapidement. Contrairement aux cellules ntES, les cellules ntES-iPS démontrent une augmentation de l’expression des marqueurs de pluripotence et survivent à la culture cellulaire prolongée. Les résultats présentés dans ce mémoire attestent que l’utilisation de la reprogrammation secondaire de cellules FF et ES clonées permet la production de cellules souches pluripotentes autologues stables chez le cheval. / For veterinarians, regenerative medicine in horses has focused mainly in the use of stem cells for arthritis, tendon and ligament repair, indicating a need for treating musculoskeletal injuries. The recent developments in cell reprogramming have paved the way for alternative cell sources for stem cell therapies. Autologous pluripotent stem cell lines can be derived from adult cells either by direct reprogramming through induced expression of pluripotency genes (iPS) or indirectly by reprogramming through somatic cell nuclear transfer (SCNT) followed by the derivation of embryonic stem cells (ESC). However, outcome efficiencies of SCNT and iPS protocols are invariably low, indicating that alone neither of these reprogramming routes is sufficient for deriving genetically and epigenetically stable pluripotent stem cells. We hereby report on the production of autologous equine iPS cells by combining SCNT and iPS reprogramming protocols. Adult skin fibroblasts were used for SCNT, and the resulting cloned embryos were either used to obtain cloned fetal fibroblast cells (ntFF), or used for ESC culture (ntES). Cells were then transfected with reprogramming factors to derive autologous iPS cells. Both ntFF-iPS and ntES-iPS cells are capable of extensive proliferation and express important pluripotency factors. However, ntES reprogramming efficiency is significantly higher than ntFF cells, with ntES-iPS colonies forming three times faster. Additionally, ntES-iPS cells showed improved pluripotency marker expression when compared with ntES cells. The results presented in this memoir indicate that stable equine iPS cell lines may be readily obtained from secondary reprogramming of cloned ntFF and ntES cells, opening novel avenues for developing autologous pluripotent stem cell therapies.

Les microglies sont les cellules immunitaires du système nerveux central. Elles sont essentielles pour son bon fonctionnement et son homéostasie. Avec l’âge, elles adoptent une morphologie dystrophique accompagnée d’un dérèglement de leurs fonctions homéostatiques. Le dysfonctionnement microglial associé au vieillissement est soupçonné de contribuer à la progression de maladies neurodégénératives. Cependant, la cause de ces changements phénotypiques est peu connue, d’autant plus chez l’humain compte tenu du manque d’accessibilité des microglies humaines âgées vivantes pour le travail moléculaire in vitro. Les travaux présentés dans ce mémoire visent donc le développement d’un modèle cellulaire qui permettrait d’étudier l’impact du vieillissement cellulaire sur la microglie humaine. Dans ce mémoire, nous formulons l’hypothèse que l’induction chimique de la sénescence dans les microglies humaines induira rapidement des caractéristiques associées au vieillissement cellulaire alors que la reprogrammation microgliale directe à partir de cellules de peau d’individus âgés maintiendra la signature associée au vieillissement cellulaire de manière physiologique. Les résultats démontrent que les microglies dans lesquelles la sénescence est chimiquement induite présentent des caractéristiques phénotypiques de vieillissement cellulaire et un dérèglement de leurs fonctions homéostatiques. De plus, les produits cellulaires obtenus par la reprogrammation microgliale directe adoptent plusieurs caractéristiques clés de la microglie, mais certaines conditions de reprogrammation directe doivent encore être déterminées afin d’obtenir un produit cellulaire authentique. Ces techniques fourniront une source renouvelable de microglies humaines âgées pouvant être dérivée de patients, afin d’étudier l’impact du vieillissement sur leurs fonctions physiologiques et sur leur interaction avec les cellules du cerveau dans les maladies neurodégénératives. / Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS). They are essential for brain functioning and cerebral homeostasis. With age, they adopt a dystrophic morphology and a disruption of their homeostatic functions occurs. Microglial dysfunction associated with aging is believed to contribute to the progression of neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease and Parkinson’s disease. However, how aging confers to microglia this change in phenotype is still unknown, especially in human given the lack of accessibility of live human aged microglia for in vitro molecular work. As such, the work presented in this Master’s thesis aims the development of a cellular model in which the effect of aging on microglial function can be studied in human microglia. In this paper, we formulate the hypothesis that chemical induction of senescence in human microglia rapidly induces phenotypic characteristics of cellular aging, whereas direct microglial reprogramming from fibroblasts of elderly individuals will maintain the aging signature following cellular conversion. The results obtained show that microglia in which senescence is chemically induced show phenotypic characteristics of cellular aging as well as disruption of their homeostatic functions. On the other hand, cellular product obtained from microglial reprogramming adopt several key features of human microglia, but some direct microglial reprogramming conditions still need to be determined in order to obtain a cell product closely resembling human microglia. These two methods will provide a renewable source of patient-derived aged microglia to study the impact of aging on their physiological functions and on their interaction with other CNS cells in neurodegenerative diseases.

Les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) régulent une multitude de processus cellulaires, incluant la prolifération, la survie et la différenciation. Ces kinases représentent l’élément terminal de la voie ERK/MAPK, laquelle est activée dans près de 30% de tous les cancers humains et donc généralement perçue comme étant un effecteur critique de la progression tumorale. Cependant, une accumulation d’observations suggèrent que les kinases ERK pourraient également induire la suppression tumorale. Le but premier de cette thèse est de démontrer comment la signalisation par ERK peut contribuer à la suppression tumorale et de concilier les mécanismes impliqués avec son rôle dans la progression du cancer. Puisque nos travaux ont une incidence sur les bénéfices attendus de certaines thérapies actuellement en développement, le deuxième objectif de la thèse est de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour combattre le cancer. Nous avons démontré qu’une hyperactivation des kinases ERK induit la sénescence cellulaire. Le mécanisme implique la dégradation sélective et dépendante du protéasome de nombreuses protéines, ce que nous avons nommé le SAPD (Senescence-Associated Protein Degradation). Ce processus cible des protéines requises pour différentes fonctions cellulaires, incluant la progression du cycle cellulaire, les fonctions mitochondriales et la biogenèse des ribosomes. Ensuite, nos résultats montrent qu’en plus d’inhiber l’établissement de la sénescence, une diminution de la signalisation par les kinases ERK favorise la reprogrammation cellulaire, laquelle permet aux cellules précancéreuses de développer leur tumorigénicité et aux cellules cancéreuses d’acquérir des propriétés attribuables aux cellules souches. Ces observations suggèrent que les mécanismes qui inhibent la voie ERK/MAPK pourraient favoriser l’initiation du cancer, la formation de métastases et la résistance à diverses thérapies. Enfin, nous avons démontré que la metformine, utilisée pour le traitement du diabète, inhibe le facteur de transcription NF-kB. Ce dernier joue un rôle central dans la reprogrammation cellulaire et dans la production de cytokines pro-inflammatoires nocives par les cellules sénescentes. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que la metformine pourrait être utilisée en combinaison avec certaines thérapies afin d’éviter les effets secondaires tant d’une inhibition des kinases ERK que d’une hyperactivation. Globalement, les résultats présentés démontrent que l’effet de la voie ERK/MAPK dépend de la force de son activation. Alors qu’une activation modérée peut contribuer à la prolifération de la plupart des cellules, une forte activation induit la sénescence tandis qu’au contraire, une faible activation favorise la reprogrammation des cellules cancéreuses et donc une augmentation de l’agressivité de la tumeur. Cette polyvalence de la voie suggère une certaine prudence face à l’usage des inhibiteurs de la voie ERK/MAPK. Cependant, elle nous motive à travailler au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, lesquelles pourraient inclure la metformine. / The Extracellular Signal-Regulated Kinases (ERK1/2) regulate multiple cellular processes such as proliferation, survival and differentiation. These kinases are the last component of the ERK/MAPK pathway, which is activated in about 30% of all human cancers. Therefore, current thinking proposes that the ERK/MAPK pathway is a critical mediator of tumor progression. However, a steadily growing number of observations suggest that ERK kinases could trigger tumor suppression as well. The first aim of this thesis is to determine how ERK signaling triggers tumor suppression and to try to reconcile these mechanisms with its putative contribution to tumor progression. Since our work has a profound impact on the value of some therapies currently in development, the second aim of the thesis is to propose new strategies to fight cancer. We found that hyperactivation of the ERK kinases induces cellular senescence. Mechanistically, this involves selective proteasome-dependent protein degradation. This “Senescence-Associated Protein Degradation” (SAPD) targets proteins required for several cellular functions, including cell cycle progression, mitochondrial functions and ribosome biogenesis. Furthermore, our results showed that downregulation of ERK signaling not only inhibits the establishment of senescence but promotes cellular reprogramming, thereby allowing precancerous cells to gain tumorigenicity and cancer cells to acquire stem cell-like properties. These results suggest that mechanisms downregulating the ERK/MAPK pathway could promote cancer initiation, metastasis and resistance to multiple therapies. Finally, we demonstrated that the antidiabetic drug metformin targets the transcription factor NF-kB. The latter plays a central role in reprogramming, but also in the generation of deleterious pro-inflammatory cytokines by senescent cells. Hence, we suggest that metformin could be used in combination with other therapies to avoid the side effects of either downregulating or overactivating ERK signaling. Taken together, the results presented in this thesis demonstrate that the outcome of the ERK/MAPK pathway activity depends on signaling strength. While a moderate activation of the pathway may contribute to cell proliferation, a strong activation induces senescence and, conversely, a low activation promotes cancer cell reprogramming. This versatility of the pathway suggests caution with the use of ERK/MAPK pathway inhibitors, but motivates us to develop new therapeutic strategies, which could include metformin.

Différentes études ont montré que les facteurs liés au mode de vie, de même que le vieillissement ou l’amélioration des tests de diagnostic et de screening, ne peuvent à eux seuls expliquer l’incidence croissante des cancers dans les pays dits industrialisés. Bien que des changements de comportements aient conduit à une diminution du nombre de cancers en France, l’incidence des carcinomes hépatocellulaires est toujours en augmentation. D’autres facteurs oncogéniques, tels que l’exposition à des cancérogènes de l’environnement pourraient intervenir. Parmi ceux-ci, les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), dont le benzo[a]pyrène (B[a]P) est le chef de file, et qui sont retrouvés notamment dans la fumée de cigarette, les gaz d’échappements ou les aliments grillés, constituent une priorité en termes de santé publique du fait de leurs effets cancérogènes. Une caractéristique-clé commune à tous les cancers a trait à leur métabolisme énergétique particulier, basé sur la glycolyse. Cependant, rien n’est connu quant à une possible reprogrammation métabolique due aux HAP. L’objectif global de mon projet de thèse a donc été d’étudier l’impact in vitro du B[a]P, utilisé à faible concentration, sur le métabolisme énergétique, de préciser le rôle de la reprogrammation métabolique dans le contrôle de la balance survie/apoptose par le B[a]P et de caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Nous avons d’abord identifié une production de monoxyde d’azote (NO) résultant de l’activation de la iNOS par le B[a]P, et agissant comme un signal de survie, possiblement via une hyperpolarisation mitochondriale. Nous avons ensuite démontré que le B[a]P induit une reprogrammation métabolique des cellules en favorisant un métabolisme glycolytique au détriment de la phosphorylation oxydative. Enfin, nous avons identifié IF1, l’inhibiteur physiologique de la F0F1ATPase, comme une nouvelle cible des HAP, participant à la reprogrammation métabolique et capable de promouvoir la survie sous l’effet du B[a]P. Au total, nous montrons que ces altérations du métabolisme mitochondrial promues par le B[a]P, sont à l’origine de signaux de survie dans notre modèle de cellules épithéliales hépatiques F258. Ces mécanismes pourraient ainsi contribuer à la progression tumorale sous l’effet des HAP. / Various studies have shown that factors related to lifestyle (smoking, diet, etc.), as well as aging or even the improved efficiency of diagnostic and screening tests, cannot explain by themselves the rising incidence of cancers in the industrialized countries. Although evolution of behaviors has helped reducing the number of cancers in France, the incidence of hepatocellular carcinomas is still increasing. This alarming result could be related to other oncogenic factors such as chronic exposure to environmental carcinogens. Among these compounds, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), including benzo[a]pyrene (B[a]P), the prototype carcinogen of this family, especially found in cigarette smoke, exhaust fumes or grilled food, are a priority in terms of public health due to their high carcinogenic potential. A key feature of cancer cells is related to their predominant glycolytic metabolism. However, nothing is known yet about a possible metabolic reprogramming upon PAH exposure. My PhD project has aimed at characterizing the impact of a low B[a]P concentration on energy metabolism, at clarifying the role of such a metabolic reprogramming in cell fate determination, and at elucidating the cellular and molecular basis of this phenomenon. We first identify a production of nitric oxide (NO), involving the activation of iNOS by B[a]P, and acting as a survival signal. We then demonstrate that B[a]P induces a metabolic reprogramming, thus promoting a glycolytic metabolism at the expense of oxidative phosphorylation. Finally, we identify IF1, the physiological inhibitor of the F0F1ATPase as a new target of PAHs, which participates in the B[a]P-elicited metabolic reprogramming and survival. To sum up, we identify new alterations of mitochondrial metabolism, acting as survival signals in B[a]P-treated rat hepatic epithelial F258 cells. These mechanism could therefore contribute to tumor progression.

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Les cellules souches pluripotentes induites (iPS) partagent avec les cellules souches embryonnaires la capacité à se différencier en tous les types cellulaires d'un organisme, mais leur obtention ne nécessite pas l'utilisation d'embryons. Elles sont générées par la surexpression de facteurs de transcription embryonnaires au sein de cellules somatiques. Les iPS représentent un outil de choix en biologie fondamentale et appliquée ainsi qu'en médecine régénérative.La plupart des protocoles de génération d'iPS reposent sur un transfert des séquences nucléotidiques codant les facteurs de transcription embryonnaires impliqués dans la mise en place du réseau de pluripotence. Bien qu'efficaces, ces méthodes présentent des problèmes de sécurité majeurs, incompatibles avec une utilisation clinique des iPS générées. La voie la plus rationnelle pour produire des iPS de manière parfaitement sécurisée est d'apporter les facteurs exogènes directement sous leur forme protéique. Des protocoles de reprogrammation par transfert de protéines ont été récemment développés, mais les efficacités associées sont relativement faibles et les protocoles relativement fastidieux.L'objectif de ce projet de thèse était de mettre au point une nouvelle approche de transfert de protéines, sécurisée et simplifiée, pour la génération de cellules souches pluripotentes induites utilisables en clinique. Les cellules à reprogrammer ont été choisies en fonction des applications potentielles des iPS générées : (i) les fibroblastes, faisant référence dans la bibliographie et permettant d'envisager des thérapies autologues avec notamment de nombreuses applications en hématologie ; (ii) les cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon, l'un des matériaux biologiques les plus sûrs, afin de générer des globules rouges in vitro, dans la perspective de répondre aux demandes croissantes en terme de transfusion, en particulier pour les groupes sanguins rares.Nous avons donc comparé les différents vecteurs de transduction de protéines développés par l'équipe TheREx du laboratoire TIMC-IMAG, en termes de facilité de production, d'efficacité de transfert ainsi que sur l'activité des facteurs de transcription associés. Le vecteur sélectionné est une micro-seringue naturelle portée par la bactérie Pseudomonas aeruginosa, capable d'injecter les facteurs Oct4, Sox2, Nanog et Lin28 (facteurs de Thomson) mais aussi c-Myc, directement dans le cytoplasme des cellules cibles, sans étape de purification nécessaire. Les facteurs de transcription injectés sont adressés jusqu'au noyau des cellules en moins de 2h, où ils activent rapidement la transcription des gènes de pluripotence, avec des réponses significatives mesurées dès 24h après injection. Nous avons également mis en évidence le caractère sécurisé et contrôlable du vecteur puisque nous sommes capables d'éliminer complètement les bactéries des cultures grâce à un traitement antibiotique, et ce dès quelques heures après l'injection. Des optimisations des conditions de reprogrammation ont été réalisées en modifiant les principaux paramètres que sont, le choix des facteurs de transcription, la fréquence des injections et le ratio bactéries : cellules.Ainsi, bien que nous ne soyons pas parvenus à générer des iPS à ce jour avec ce système, la micro-seringue naturelle que nous avons développé et optimisé se positionne comme un vecteur de choix pour le transfert de protéines dans l'optique de générer des iPS, en termes d'efficacité de vectorisation et d'induction transcriptionnelle, de sécurité mais aussi de facilité d'utilisation. / Like embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS) are characterized by their ability to differentiate into any cell type in an organism. However their use doesn't raise the ethical issue linked to the use of embryos. iPS are generated from somatic cells by overexpression of embryonic transcription factors. iPS are thereby very promising in fundamental and applied biology as well as for regenerative medicine.Most of the protocols used to generate iPS are based on the delivery of nucleic acid sequences encoding embryonic transcription factors responsible for the activation of the pluripotency gene network. In spite of their efficiency, these methods are associated with major safety concerns incompatible with clinical applications. The more rational path to safely produce iPS is to deliver the exogenic transcription factors under their protein form. Recently some protocols using protein delivery have been developed to produce iPS. However associated efficiencies are very low and protocols are quite fastidious.The aim of this Ph.D. project was to develop a new efficient and simplified protein delivery method for the safe generation of iPS compatible with clinical applications. Cell sources were selected depending of the final applications of iPS: (i) fibroblasts, extensively used and described in bibliography and allowing autologous therapies with many applications in the field of hematology; (ii) cord blood hematopoietic stem cells, one of the safest biomaterials, with the aim to generate red blood cells in vitro in order to respond to increasing needs for transfusion products, particularly for rare blood types.First, different protein vectors developed by the TheREx team of the TIMC-IMAG laboratory were compared for their efficiency of production and delivery as well as for the activity of associated factors. The selected vector is a natural micro-syringe expressed by Pseudomonas aeruginosa, able to inject the transcription factors Oct4, Sox2, Nanog and Lin28a (Thomson combination) with c-Myc directly into the cytoplasm of target cells, without the need for any purification step. Once injected, transcription factors are addressed to the nucleus in less than 2 hours where they efficiently activate transcription of pluripotency genes, with significant responses observed as early as 24h after injection. We also highlighted the secured and controllable nature of this vector by completely eliminating the bacteria from the cultures in a few hours after injection with an antibiotic treatment. Optimizations of the reprogramming conditions were also made by adjusting many parameters such as the combination of transcription factors, the injection frequency and the bacteria : cell ratio.

Le choc septique reste une pathologie grave, associée à des taux de mortalité et d'infections nosocomiales (IN) secondaires élevés. La prédiction du pronostic est de la plus haute importance pour sélectionner les patients qui pourraient bénéficier de traitements visant à moduler la réponse immunitaire. Le système immunitaire, classiquement active par des agents externes, peut également être activé par des médiateurs endogènes exprimés à la suite d'une agression d'origine septique ou non. Les protéines S100 font partie de ces signaux de danger endogènes (ou alarmines). Le but de ce travail est d'évaluer la capacité de l'ARNm de S100A9 mesuré dans le sang total de patients en choc septique à prédire la survie et la survenue d'IN. Nous avons également étudié la régulation de l'expression des ARN messagers de S100A8 et S100A9 dans un modèle ex vivo de tolérance à l'endotoxine qui reproduit partiellement les dysfonctions de l'immunité innée induites par le sepsis. L'ARNm de S100A9 est surexprimé dans le sang des patients en choc septique. Un taux élevé entre le 7eme et le 10eme jour du début du choc septique est associé à la survenue d'IN secondaires. Ex vivo, l'expression des ARNm de S100A8 et S100A9 est augmentée durant le phénomène de tolérance à l'endotoxine. Le blocage de l IL-10 et l'administration d'IFN-γ réduisent l'augmentation de ces ARNm dans ce modèle. Apres confirmation dans des études cliniques, ces résultats préliminaires suggèrent que l'expression des ARNm de S100A8 et S100A9 puisse être utilisée comme marqueur du phénomène de tolérance à l'endotoxine et comme outils pour évaluer la dysfonction immunitaire des patients en choc septique. Ces patients pourraient alors bénéficier de thérapies visant à restaurer leurs fonctions immunitaires / Septic shock remains a serious disease with high mortality and increased risk of hospital-acquired infection. The prediction of outcome is of the utmost importance for selecting patients for therapeutic strategies aiming to modify the immune response. Immune system, typically activated by external agents, can also be activated by endogenous mediators induced by various types of stress (trauma, infection, burns). S100 proteins are part of the alarmins family. The aim of this study was to assess the capability of S100A9 messenger RNA in whole blood from patients with septic shock to predict survival and the occurrence of hospital-acquired infection. We also investigate the regulation of S100A8 and S100A9 mRNA expressions in an ex vivo model of endotoxin tolerance which partially reproduces sepsis-induced innate immune alterations. S100A9 messenger RNA is increased in septic shock and its delayed overexpression is associated with the occurrence of secondary hospital-acquired infection. Ex vivo, S100A8 and S100A9 mRNA expressions are increased during endotoxin tolerance. IL-10 blockade and rIFN-γ treatment partially abrogated S100A8/A9 mRNA increases in this model. Pending confirmation in larger, independent clinical studies, these preliminary results suggest that S100A8 and S100A9 mRNA levels might be used as surrogate markers of endotoxin tolerance and as evaluation tools for immune dysfunctions in septic shock patients. These patients could be selected for therapeutic aiming to restore immune functions

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