El objetivo de la presente tesis es el de aportar conocimiento sobre la bioquímica y la farmacología de los receptores de adenosina, así como entender las relaciones entre estructura química y actividad farmacológica de los ligandos existentes para estos receptores. Con este objetivo se han empleado distintas técnicas y metodologías del diseño de fármacos asistido por ordenador. Los resultados presentados en este trabajo incluyen:· El desarrollo de una estrategia original para la selección de una muestra que cubra adecuadamente la diversidad molecular existente en una base de datos de compuestos químicos· La construcción de un modelo de la región transmembrana del receptor A1 humano de adenosina, en el que se ha localizado y caracterizado un sitio de unión de agonistas compatible con los datos experimentales.· Predicciones teóricas de las energías de unión de ligandos, realizadas a partir de los complejos agonista-receptor predichos sobre el modelo mencionado, obteniendo un grado de acuerdo con los datos experimentales que resulta esperanzador / The goal of the present thesis is to gain knowledge about the biochemistry and pharmacology of adenosine receptors, as well as to understand structure-activity relationships for the existing ligands for this receptors. In order to achieve this goal, we have used several techniques and methodologies from the computer-aided drug design field. Results presented in this work include:· The development of an original strategy of selection of a maximum diversity sample that adequately covers the original molecular diversity contained in a compound database· The building of the transmembrane region of a human A1 adenosine receptor model. In such a model, an agonists binding site has been located and characterized, showing agreement with experimental data.· The resulting ligand-receptor complexes have been studied with computational approaches for the prediction of ligand-binding free energies. A nice correlation with experimental results was observed

La adicción es un trastorno crónico de la conducta caracterizado por la búsqueda y el consumo compulsivos de la droga, la pérdida de control para limitar dicho consumo, a aparición de un estado emocional negativo cuando el acceso a la droga está impedido y la recaída en el proceso incluso tras largos períodos de abstinencia. El sistema dopaminérgico mesolímbico cortical ha sido propuesto como la principal base neurobiológica de la adicción, sin embargo existen otros sistemas de neurotransmision que participan en la consolidación del proceso adictivo.El sistema endocannabinoide, a traves del receptor CB1, participa en las propiedades adictivas de diferentes drogas de abuso como el delta9-tetrahidrocannabinol, la nicotina y la morfina. Sin embargo, hasta el momento de iniciar este trabajo, pocos estudios han demostrado una clara implicación del sistema endocannabinoide en las propiedades reforzantes de los psicoestimulantes. Mediante el uso de ratones CB1 knockout, hemos demostrado que el receptor CB1 participa en la eficacia reforzante de la cocaína. Además, la presencia de dicho receptor es necesaria para los procesos de consolidación de una conducta operante mantenida por la autoadministración de cocaína. Este estudio demuestra la importancia de dicho receptor CB1 en las propiedades adictivas de la cocaína, confirmando que el sistema endocannabinoide es un sustrato común para la adicción de drogas de abuso. Por otra parte, el sistema purinérgico modula numerosos sistemas de neurotransmisión en el SNC. La estrecha relación a nivel celular y funcional entre los receptores de adenosina y los receptores dopaminérgicos proporciona evidencias de que el sistema purinérgico podría modular los sistemas de recompensa. Utilizando diferentes modelos animales, hemos demostrado que los receptores de adenosina A2A son necesarios para que las propiedades adictivas de las drogas de abuso como los cannabinoides, los opioides, la nicotina y los psicoestimulantes se produzcan de un modo completo.Nuestros estudios nos permiten afirmar que ambos sistemas, el cannabinoide y el purinérgico podría suponer la existencia de nuevos sistemas de modulación común de los procesos adictivos. Asi, sería de gran interés desarrollar nuevas estrategias de bloqueo de los receptores A2A y CB1 para atenuar e incluso prevenir el desarrollo de la adicción. / Drug addiction is a chronically relapsing disorder that is defined by a compulsion to take the drug intake, a loss of control in limiting intake and a withdrawal-negative affect state when the access to the drug is interrupted. Mesolimbic dopaminergic system has been proposed as a fundamental neurobiological substrate for drug addiction. However, there is evidence for other neurotransmitter systems involved in the consolidation of the addictive process. The endocannabinoid system, through the activation of CB1 receptor, participates in the addictive properties of different drugs of abuse such as delta9-tetrahydrocannabinol, morphine and nicotine. Nevertheless, few studies have revealed an important implication of CB1 receptor in the reinforcing properties of psychostimulants. By using CB1 knockout mice, we have demonstrated that CB1 receptor participates in the reinforcing efficacy of cocaine. Moreover, this receptor is necessary for the consolidation processes involved in cocaine maintained intravenous self-administration. Therefore, this study reveals an essential role of CB1 receptor in cocaine addictive properties, confirming that the endocannabinoid system is a common substrate of addiction to drugs of abuse.On the other hand, the purinergic system modulates different neurotransmitter systems in the CNS. Adenosine receptors are closely related to dopaminergic receptors at both cellular and functional levels, suggesting that purinergic system could modulate the reward systems. By using different animal models, we have demonstrated that A2A adenosine receptors are necessary for the development of the addictive properties of drugs of abuse such as opioids, cannabinoids, nicotine and cocaine. Our studies suggest that both cannabinoid and purinergic systems could represent new and common modulatory systems of addictive processes. Thus, it would be of interest to develop new therapeutic targets blocking CB1 and A2A receptors to attenuate the development of addiction.

Introdução: A privação de sono (PdS) tem sido utilizada como um estratégia alternativa para o tratamento do Transtorno Depressivo Maior (TDM), contudo sua eficácia e efetividade carecem de estudos homogêneos e de bom delinemento para dar um grau de evidência científica para seu uso na prática diária. Assim sendo, desde a primeira publicação, em 1971, num relato de caso de um paciente com TDM grave tipo melancólico, por Plug e Tölle, o mesmo estava assintomático no dia seguinte à privação total de sono. Contudo, na noite seguinte de sono seus sintomas depressivos retornaram. Nestes quase 40 anos desde esta publicação houve dezenas de estudos em sua maioria relatos de caso, série de casos ou até estudos abertos só que misturando pacientes com TDM com Depressão Bipolar sem mesmo distinguir se tipo I ou II. A cafeína com seu efeito estimulador poderia ser uma alternativa para facilitar a privação de sono. No entanto, não há dados sobre o sua potencial influência no efeito antidepressivo da PdS. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da cafeína na PdS em pacientes deprimidos unipolares moderados a graves não psicóticos. Métodos: Ensaio Clínico randomizado, duplo cego, cruzado, comparando cafeína contra placebo em pacientes deprimidos moderados a graves submetidos à privação total de sono (PdS). Os pacientes foram avaliados por itens da escala de Lader, HAMD- 6 itens, CGI Severidade e Melhora Global. Resultados: Foram avaliados 20 pacientes. Os pacientes que usaram cafeína mantiveram o mesmo escore de energia pré e pós-privação de sono (item energético-letárgico da escala de Lader) enquanto os do grupo placebo diminuíram o escore de energia pós-privação de sono. (p = 0,0045). Não houve diferença entre o grupo cafeína e placebo nos demais itens da escala de Lader. Conclusão: O uso combinado de cafeína e PdS pode ser uma estratégia útil para manter os pacientes mais acordados sem o prejuízo do cansaço da PdS em pacientes ambulatoriais deprimidos. Contudo, mais estudos envolvendo pacientes que tenham 10 respondido à PdS são necessários para verificar se a cafeína também não interfere nos resultados deste grupo. / Introduction: Sleep deprivation (SD) has been used as an alternative approach to treat major depressive disorder (MDD), however the efficacy and the effectiveness needs studies with homogeneity and better delineament to strengthen the evidence based medicine to the use in the practical daily use. Besides, since the 1° puplication in 1971 of a case report, by Plug and Tölle, in that one patient with severe melancholic depressive disorder achieved remission in the next day after a total sleep deprivation. However his depressive sintomtology was back after the next night of sleep. Since this almost 40 years, a lot of papers were puplished, and the majority where case report, case reports and open trials with patients with MDD, bipolar depression without make difference between tipe I or II. Caffeine, due to its stimulating effect, could be an alternative to promote sleep deprivation. However, there are no data about its potential influence on the antidepressive effect of SD. The objective of this study is to assess the effect of caffeine on SD in non-psychotic patients with moderate to severe unipolar depression. Methods: Randomized, double-blind, crossover clinical trial comparing caffeine and placebo in moderate to severe depressed patients who underwent total sleep deprivation (SD). The patients were assessed with items of the Bond-Lader Scale, the 6-item Hamilton Depression Rating Scale (HAMD-6), and the Clinical Global Impression (CGI)-Severity/Improvement. Results: Twenty patients participated in this study. The patients who consumed caffeine presented the same score of energy before and after sleep deprivation (lethargicenergetic item of the Bond-Lader scale), while the patients in the placebo group had a reduced score of energy after sleep deprivation (p = 0.0045). There was no difference between the caffeine and placebo groups in the other items of the Bond-Lader scale. Conclusion: The combined use of caffeine and SD can be a useful strategy to keep the 12 patient awake without impairing the effect of SD on depressed outpatients. However, further studies involving patients who have responded to SD are needed in order to verify if caffeine also does not interfere with the results in this group.

Introdução: A privação de sono (PdS) tem sido utilizada como um estratégia alternativa para o tratamento do Transtorno Depressivo Maior (TDM), contudo sua eficácia e efetividade carecem de estudos homogêneos e de bom delinemento para dar um grau de evidência científica para seu uso na prática diária. Assim sendo, desde a primeira publicação, em 1971, num relato de caso de um paciente com TDM grave tipo melancólico, por Plug e Tölle, o mesmo estava assintomático no dia seguinte à privação total de sono. Contudo, na noite seguinte de sono seus sintomas depressivos retornaram. Nestes quase 40 anos desde esta publicação houve dezenas de estudos em sua maioria relatos de caso, série de casos ou até estudos abertos só que misturando pacientes com TDM com Depressão Bipolar sem mesmo distinguir se tipo I ou II. A cafeína com seu efeito estimulador poderia ser uma alternativa para facilitar a privação de sono. No entanto, não há dados sobre o sua potencial influência no efeito antidepressivo da PdS. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da cafeína na PdS em pacientes deprimidos unipolares moderados a graves não psicóticos. Métodos: Ensaio Clínico randomizado, duplo cego, cruzado, comparando cafeína contra placebo em pacientes deprimidos moderados a graves submetidos à privação total de sono (PdS). Os pacientes foram avaliados por itens da escala de Lader, HAMD- 6 itens, CGI Severidade e Melhora Global. Resultados: Foram avaliados 20 pacientes. Os pacientes que usaram cafeína mantiveram o mesmo escore de energia pré e pós-privação de sono (item energético-letárgico da escala de Lader) enquanto os do grupo placebo diminuíram o escore de energia pós-privação de sono. (p = 0,0045). Não houve diferença entre o grupo cafeína e placebo nos demais itens da escala de Lader. Conclusão: O uso combinado de cafeína e PdS pode ser uma estratégia útil para manter os pacientes mais acordados sem o prejuízo do cansaço da PdS em pacientes ambulatoriais deprimidos. Contudo, mais estudos envolvendo pacientes que tenham 10 respondido à PdS são necessários para verificar se a cafeína também não interfere nos resultados deste grupo. / Introduction: Sleep deprivation (SD) has been used as an alternative approach to treat major depressive disorder (MDD), however the efficacy and the effectiveness needs studies with homogeneity and better delineament to strengthen the evidence based medicine to the use in the practical daily use. Besides, since the 1° puplication in 1971 of a case report, by Plug and Tölle, in that one patient with severe melancholic depressive disorder achieved remission in the next day after a total sleep deprivation. However his depressive sintomtology was back after the next night of sleep. Since this almost 40 years, a lot of papers were puplished, and the majority where case report, case reports and open trials with patients with MDD, bipolar depression without make difference between tipe I or II. Caffeine, due to its stimulating effect, could be an alternative to promote sleep deprivation. However, there are no data about its potential influence on the antidepressive effect of SD. The objective of this study is to assess the effect of caffeine on SD in non-psychotic patients with moderate to severe unipolar depression. Methods: Randomized, double-blind, crossover clinical trial comparing caffeine and placebo in moderate to severe depressed patients who underwent total sleep deprivation (SD). The patients were assessed with items of the Bond-Lader Scale, the 6-item Hamilton Depression Rating Scale (HAMD-6), and the Clinical Global Impression (CGI)-Severity/Improvement. Results: Twenty patients participated in this study. The patients who consumed caffeine presented the same score of energy before and after sleep deprivation (lethargicenergetic item of the Bond-Lader scale), while the patients in the placebo group had a reduced score of energy after sleep deprivation (p = 0.0045). There was no difference between the caffeine and placebo groups in the other items of the Bond-Lader scale. Conclusion: The combined use of caffeine and SD can be a useful strategy to keep the 12 patient awake without impairing the effect of SD on depressed outpatients. However, further studies involving patients who have responded to SD are needed in order to verify if caffeine also does not interfere with the results in this group.

O diagnóstico da doença de Wilson (DW) é realizado por exames clínicos, laboratoriais, anatomopatológicos e de imagem. Mais de 500 mutações no gene ATP7B foram descritas como causadoras da DW. Para avaliar a importância da detecção de mutações no diagnóstico da DW em nosso meio, analisamos 35 pacientes com DW, 20 familiares de wilsonianos a partir de rastreamento familiar, 18 com hepatite crônica criptogênica e sete com insuficiência hepática aguda grave. Para o diagnóstico da DW foi utilizado o sistema de escore sugerido pela Sociedade Europeia para o Estudo do Fígado de 2012. Os dados demográficos, clínicos, laboratoriais e histológicos foram obtidos retrospectivamente. Obteve-se o DNA genômico de cada paciente a partir de sangue periférico e realizou-se o sequenciamento direto dos 21 éxons e suas bordas intrônicas do gene ATP7B. Todos os pacientes com DW apresentavam no mínimo quatro pontos. No grupo de rastreamento familiar o sequenciamento foi importante para o diagnóstico de DW em 14 familiares; no grupo de hepatite crônica criptogênica em oito pacientes e no grupo de insuficiência hepática aguda grave em três pacientes. Foi caracterizada uma família com cinco genótipos diferentes (dois homozigotos p.A1135Qfs/p.A1135Qfs e p.M645R/p.M645R), um heterozigoto composto (p.A1135Qfs/p.M645R) e dois heterozigotos simples (p.A1135Qfs/0 e p.M645R/0) com fenótipos variados. Foram detectadas duas mutações em heterozigose simples em pacientes com insuficiência hepática aguda grave. A mutação p.A1135Qfs e p.L708P foram as mais frequentes em todos os grupos. Foi identificada pela primeira vez a mutação p.M645R em homozigose. Concluímos que os resultados confirmaram que o sequenciamento do gene ATP7B foi útil: 1) para confirmar que as mutações p.A1135Qfs e p.L708P são as mais importantes na população brasileira; 2) para demonstrar que a mutação tida como a mais frequente na Europa, a p.H1069Q, tem bem menor importância em nosso meio, embora mais frequentemente do que o observado anteriormente; 3) para confirmar (ou excluir) precocemente o diagnóstico e evitar a realização de exames desnecessários e invasivos e iniciar (ou não realizar) o tratamento, com base mais sólida, em pacientes com hepatopatia crônica idiopática e em familiares de portadores de DW; 4) para definir o diagnóstico de DW em casos de insuficiência hepática aguda grave, diagnóstico ainda que tardio, mas de suma importância para realização de estudo familiar subsequente, 5) para identificação não esperada de heterozigotos simples e polimorfismos de significado ainda não esclarecido em pacientes com insuficiência hepática aguda grave; 6) para identificação de casos inusitados de três genótipos diferentes causadores da doença na mesma família (homozigose de duas mutações diferentes e heterozigose composta); 7) para melhor definir que a mutação p.M645R em homozigose tem potencial para desenvolver a DW, embora resultados de estudos em in vitro sugiram função normal da proteína defeituosa sintetizada; 8) para definir que há casos de doentes com a mutação p.M645R em heterozigose composta de evolução extremamente benigna, com diagnóstico após a quinta década de vida, com discretas alterações hepáticas. Porém há casos com evolução mais grave tanto do ponto de vista hepático quanto neurológico, possivelmente influenciados pelas mutações que a acompanham / Wilson\'s disease (WD) is an autosomal recessive disorder secondary to mutations in the ATP7B gene resulting in toxic accumulation of copper in various tissues. The diagnosis of WD is made by the analysis of clinical, laboratory, histological findings and imaging tests. More than 500 mutations have been described in the ATP7B gene as the cause of WD. In order to expand the knowledge of the importance of mutation detection in the diagnosis of WD, we analyzed 36 patients with WD, 20 individuals from family screening, 18 with cryptogenic chronic hepatitis and seven with severe acute liver failure. For the diagnosis of WD the International Scoring System suggested by the European Association for the Study of the Liver (EASL) in 2012 was used. Demographic, clinical, laboratory and histological data were obtained retrospectively. Direct sequencing of 21 exons and intron boundaries of ATP7B gene was performed in genomic DNA extracted from peripheral blood leucocytes of all subjects. All patients with WD have at least four points of the scoring system without considering the DPA challenge test. In the family screening group, sequencing was important for the diagnosis of DW in fourteen patients; eight patients in the group of cryptogenic chronic hepatitis, and three patients in the group of severe acute liver failure. Five different genotypes were identified in one family (two homozygous, p.A1135Qfs/p.A1135Qfs and p.M645R/p.M645R, one compound heterozygous p.A1135Qfs/p.M645R, and two simple heterozygous p.A1135Qfs/0 and p.M645R/0). Two patients with acute liver failure were detected as simple heterozygous. The p.A1135Qfs and p.L708P were the most frequent mutations in all groups. It is the first time p.M645R mutation was detected in homozygosity. The ATP7B gene sequencing was useful: 1) to confirm that p.A1135Qfs and p.L708P mutations are the most frequent in the Brazilian population; 2) to confirm that the most common mutation in Europe, p.H1069Q has lower frequency in our area; 3) to confirm (or exclude) an early diagnosis and to avoid unnecessary and invasive tests and to initiate (or not) the specific treatment with a stronger basis in patients with chronic liver disease and individuals from family screening of patients with Wilson disease; 4) to confirm the diagnosis, although late, of cases with severe acute liver failure, but very important to perform family screening; 5) to identify simple heterozygotes in patients with severe acute liver failure; 6) to describe unusual cases of three different genotypes of WD patients in a same family (two different homozygous mutations and one compound heterozygous); 7) to better define that p.M645R mutation in homozigosity develops WD, although the results from in vitro studies suggested a normal function for the defective synthesized protein; 8) to define that there are patients with p.M645R mutations in compound heretozigosity with a very benign clinical picture, with late diagnosis, after the fifth decade of life, with mild liver alterations. However, there are patients with a more severe clinical evaluation, hepatic or neurologic, probably secondary to the influence of the other mutation

Introdução: A privação de sono (PdS) tem sido utilizada como um estratégia alternativa para o tratamento do Transtorno Depressivo Maior (TDM), contudo sua eficácia e efetividade carecem de estudos homogêneos e de bom delinemento para dar um grau de evidência científica para seu uso na prática diária. Assim sendo, desde a primeira publicação, em 1971, num relato de caso de um paciente com TDM grave tipo melancólico, por Plug e Tölle, o mesmo estava assintomático no dia seguinte à privação total de sono. Contudo, na noite seguinte de sono seus sintomas depressivos retornaram. Nestes quase 40 anos desde esta publicação houve dezenas de estudos em sua maioria relatos de caso, série de casos ou até estudos abertos só que misturando pacientes com TDM com Depressão Bipolar sem mesmo distinguir se tipo I ou II. A cafeína com seu efeito estimulador poderia ser uma alternativa para facilitar a privação de sono. No entanto, não há dados sobre o sua potencial influência no efeito antidepressivo da PdS. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da cafeína na PdS em pacientes deprimidos unipolares moderados a graves não psicóticos. Métodos: Ensaio Clínico randomizado, duplo cego, cruzado, comparando cafeína contra placebo em pacientes deprimidos moderados a graves submetidos à privação total de sono (PdS). Os pacientes foram avaliados por itens da escala de Lader, HAMD- 6 itens, CGI Severidade e Melhora Global. Resultados: Foram avaliados 20 pacientes. Os pacientes que usaram cafeína mantiveram o mesmo escore de energia pré e pós-privação de sono (item energético-letárgico da escala de Lader) enquanto os do grupo placebo diminuíram o escore de energia pós-privação de sono. (p = 0,0045). Não houve diferença entre o grupo cafeína e placebo nos demais itens da escala de Lader. Conclusão: O uso combinado de cafeína e PdS pode ser uma estratégia útil para manter os pacientes mais acordados sem o prejuízo do cansaço da PdS em pacientes ambulatoriais deprimidos. Contudo, mais estudos envolvendo pacientes que tenham 10 respondido à PdS são necessários para verificar se a cafeína também não interfere nos resultados deste grupo. / Introduction: Sleep deprivation (SD) has been used as an alternative approach to treat major depressive disorder (MDD), however the efficacy and the effectiveness needs studies with homogeneity and better delineament to strengthen the evidence based medicine to the use in the practical daily use. Besides, since the 1° puplication in 1971 of a case report, by Plug and Tölle, in that one patient with severe melancholic depressive disorder achieved remission in the next day after a total sleep deprivation. However his depressive sintomtology was back after the next night of sleep. Since this almost 40 years, a lot of papers were puplished, and the majority where case report, case reports and open trials with patients with MDD, bipolar depression without make difference between tipe I or II. Caffeine, due to its stimulating effect, could be an alternative to promote sleep deprivation. However, there are no data about its potential influence on the antidepressive effect of SD. The objective of this study is to assess the effect of caffeine on SD in non-psychotic patients with moderate to severe unipolar depression. Methods: Randomized, double-blind, crossover clinical trial comparing caffeine and placebo in moderate to severe depressed patients who underwent total sleep deprivation (SD). The patients were assessed with items of the Bond-Lader Scale, the 6-item Hamilton Depression Rating Scale (HAMD-6), and the Clinical Global Impression (CGI)-Severity/Improvement. Results: Twenty patients participated in this study. The patients who consumed caffeine presented the same score of energy before and after sleep deprivation (lethargicenergetic item of the Bond-Lader scale), while the patients in the placebo group had a reduced score of energy after sleep deprivation (p = 0.0045). There was no difference between the caffeine and placebo groups in the other items of the Bond-Lader scale. Conclusion: The combined use of caffeine and SD can be a useful strategy to keep the 12 patient awake without impairing the effect of SD on depressed outpatients. However, further studies involving patients who have responded to SD are needed in order to verify if caffeine also does not interfere with the results in this group.

A ecocardiografia com perfusão miocárdica em tempo real (EPMTR) permite a quantificação do fluxo sangüíneo miocárdico e, quando realizada durante o estresse, da reserva de fluxo miocárdico (reserva Axß). Essa técnica tem potencial para ser uma importante ferramenta para o diagnóstico não-invasivo da doença arterial coronariana (DAC). Apesar do conhecimento atual das alterações fisiológicas que ocorrem com o uso de agentes vasodilatadores ou catecolaminas na circulação coronariana, não há dados na literatura comparando diretamente o valor da EPMTR, sob estresse pela dobutamina e pela adenosina, para a detecção de DAC em humanos. Os objetivos deste estudo foram: avaliar, em um mesmo grupo de pacientes, a exeqüibilidade e a acurácia da EPMTR, sob estresse pela dobutamina e pela adenosina, para a detecção de estenose arterial coronariana angiograficamente significativa e determinar o valor adicional da análise quantitativa da perfusão miocárdica sobre o eletrocardiograma de 12 derivações, da motilidade segmentar e da análise qualitativa da perfusão miocárdica obtidas durante o estresse pela dobutamina e pela adenosina. Estudamos 54 pacientes (média etária de 60±9 anos, 33 homens) com suspeita clínica de DAC e indicação de angiografia coronariana. Todos os pacientes foram submetidos à EPMTR sob estresse pela adenosina na dose de 140 g/kg/min por seis minutos e, após um intervalo de três a cinco horas, à EPMTR sob estresse pela dobutamina-atropina. O contraste ecocardiográfico utilizado foi o PESDA (Perfluorocarbon-Exposed Sonicated Dextrose and Albumin), administrado por via intravenosa periférica de forma contínua. Para ambas as EPMTR sob estresse pela dobutamina e pela adenosina, foram feitas análises do eletrocardiograma em 12 derivações (ECG), da motilidade segmentar e análise qualitativa e quantitativa da perfusão miocárdica. A quantificação da velocidade do fluxo miocárdico (ß) e do fluxo sangüíneo miocárdico (Axß) foi realizada por meio da utilização do programa computacional QLab 3.0 (Philips Medical Systems, Bothell, WA, USA). Todos os pacientes foram submetidos à angiografia coronariana quantitativa (ACQ) em um intervalo de até 30 dias da EPMTR. Foi considerada DAC a presença de lesão coronariana > 50% do diâmetro luminal. Dos 54 pacientes estudados, 25 (46%) apresentaram lesão coronariana >50% e 29 (54%) não apresentaram lesão coronariana significativa. A exeqüibilidade da quantificação da reserva Axß foi semelhante para a EPMTR sob estresse pela adenosina e pela dobutamina (91% versus 90% dos territórios arteriais; p = ns). A variabilidade da quantificação interobservador para os parâmetros de reserva ß e Axß foi de 6,8% (r = 0,98) e 5,5% (r = 0,97), respectivamente. A variabilidade intra-observador para os mesmos parâmetros foi de 2,1 % (r = 0,99) e 7,4 % (r = 0,95), respectivamente. A análise quantitativa da perfusão miocárdica, obtida pela EPMTR sob estresse pela dobutamina, apresentou sensibilidade de 84%, especificidade de 76% e acurácia de 80% para a detecção de DAC, enquanto que a EPMTR sob estresse pela adenosina apresentou sensibilidade de 88%, especificidade de 72% e acurácia de 80%. O valor incremental das modalidades estudadas para o diagnóstico de DAC foi analisado em modelo que incluiu o ECG, ECG e motilidade segmentar, ECG e motilidade segmentar e perfusão qualitativa e, por último, ECG e motilidade segmentar e perfusão qualitativa e quantitava, tanto para a EPMTR sob estresse pela dobutamina como pela adenosina (2 de 4,9 versus 20,1 versus 23,7 versus 38,4) e (2 de 9,9 versus 20,1 versus 26,7 versus 59,4), respectivamente. Concluímos que a avaliação quantitativa da EPMTR apresenta boa exeqüibilidade. A EPMTR sob estresse pela dobutamina e a pela adenosina apresentam acurácias diagnósticas similares para a detecção de lesão angiograficamente significativa. A análise quantitativa da perfusão miocárdica apresenta valor diagnóstico adicional aos outros parâmetros obtidos durante o estresse pela dobutamina e adenosina. / Real time myocardial contrast echocardiography (RTMCE) has allowed for the quantification of myocardial blood flow reserve (MBFR). This technique is a valuable tool for the noninvasive detection of coronary artery disease (CAD). Both adenosine and dobutamine are currently used stressor agents during RTMCE. Although it has already been shown the effects of these drugs on the coronary physiology, no study has directly compared both agents during RTMCE. The aims of this study were to determine the feasibility and diagnostic accuracy of adenosine versus dobutamine stress RTMCE for the detection of angiographically significant CAD. In addition, we sought to determine the additional value of quantitative RTMCE over the electrocardiogram, wall motion, and qualitative analysis of myocardial perfusion. The study involved 54 patients (60±9 years, 33 men) with suspected CAD. Patients underwent RTMCE at rest and during continuous infusion of 140g/kg/min of adenosine for six minutes, and dobutamine stress. The contrast agent used in the study was PESDA (Perfluorocarbon-Exposed Sonicated Dextrose and Albumin) administered in continuous intravenous infusion. Quantification of plateau of acoustic intensity (A) and microbubble velocity () was performed off line using a specific software (QLab 3.0, Philips Medical Systems, Bothell, WA, USA). Myocardial blood flow was determined as Ax. Quantitative coronary angiography was performed in all patients within 30 days of RTMCE, and CAD was defined as >50% luminal diameter coronary stenosis. There were 25 (46%) patients with CAD and 29 (54%) patients without obstructive lesion. The feasibility of quantitative MBFR was the same for adenosine and dobutamine stress RTMCE (91% versus 90% in all arterial territories; p=ns). The intraobserver variabilities for the measurements of ß and Axß reserve were 2.1% (r = 0.99) and 7.4% (r = 0.95), respectively. The interobserver variabilities for the same parameters were 6.8% (r = 0.98) and 5.5% (r = 0.97), respectively. The sensitivity, specificity and diagnostic accuracy of ß reserve obtained during dobutamine stress RTMCE for detecting CAD were 84%, 76%, and 80%, respectively, and during adenosine stress RTMCE they were 88%, 72% and 80%. The incremental value for the diagnosis of CAD was analyzed in a model that included the EKG, EKG and wall motion, EKG and wall motion and qualitative perfusion analysis and finally, EKG and wall motion and qualitative and quantitative perfusion analysis, for dobutamine and adenosine RTMCE (2= 4,9 versus 20,1 versus 23,7 versus s 38,4) and (2= 9,9 versus 20,1 versus 26,7 versus 59,4), respectively. In conclusion, quantitative RTMCE is a feasible technique in patients with suspected CAD. Dobutamine and adenosine stress RTMCE had similar diagnostic accuracy for the detection of angiographically significant lesion. Quantitative analysis of myocardial perfusion had incremental diagnostic value over the other parameters obtained during both dobutamine and adenosine stress RTMCE.

[pt] Neste trabalho investigou-se a complexação entre o íon alumínio e ligantes como a adenosina 5-trifosfato, a fosfocreatina e aminoácidos pelas técnicas de titulação potenciométrica, espectroscopia Raman e cálculos teóricos em solução aquosa, para conhecer as características dos compostos formados. O estudo visou subsidiar o entendimento dos mecanismos de absorção e biodisponibilidade do alumínio. Tal compreensão poderia auxiliar as pesquisas clínicas relacionadas à prevenção e ao tratamento de doenças neurodegenerativas. O alumínio está presente na água e em vegetais, carnes, laticínios e aditivos alimentares. Soluções de nutrição parenteral, fórmulas infantis e medicamentos podem conter alumínio também. Em fluidos corporais, os nucleosídeos di e trifosfatos e os aminoácidos são bons ligantes para o íon alumínio. Biomoléculas da baixa massa molecular formam complexos que aumentam o pH de precipitação do íon e sua absorção gastrointestinal. Esta pesquisa analisou seis complexos formados com o íon alumínio em solução aquosa. Os compostos binários, tetraaquaadenosina5- trifosfato alumínio(III) e aquafosfocreatina alumínio(III), foram estudados por espectroscopia Raman e cálculos quantomecânicos. As análises dos complexos ternários, adenosina5-trifosfatodiaquacisteína aluminato(III), adenosina5-trifosfatotriaquametionina aluminato(III), aquacisteínafosfocreatina aluminato(III) e aquafosfocreatinametionina aluminato(III), envolveram ainda a potenciometria. Os cálculos computacionais usaram a teoria do funcional de densidade com o funcional híbrido (B3LYP), a base 6-311++G(d,p) e consideraram o efeito do solvente água pelo modelo de contínuo polarizável. Eles englobaram a obtenção de parâmetros geométricos, o cálculo do espectro Raman e a descrição da superfície de contorno do potencial eletrostático e do mapa do potencial eletrostático. No que tange os complexos binários, as análises ratificaram o comportamento bidentado da adenosina 5-trifosfato por um oxigênio do fosfato alfa e um oxigênio do fosfato beta. No complexo formado entre o íon alumínio e a fosfocreatina, o ligante atua como tridentado por um oxigênio do fosfato, um oxigênio do carboxilato e um nitrogênio. Os mapas do potencial eletrostático apontaram a presença de regiões neutras ao redor dos átomos e como as cargas totais das moléculas eram zero, elas devem ser solúveis em lipídios. Nos complexos ternários, os modos de coordenação da adenosina 5-trifosfato e da fosfocreatina adotados nos compostos binários se mantêm. A cisteína se comporta como bidentada por um oxigênio do carboxilato e um nitrogênio. Na espécie adenosina5-trifosfatotriaquametionina aluminato(III), a metionina atua como monodentada pelo oxigênio do carboxilato. A despeito da carga total negativa dos complexos, as moléculas não apresentam um potencial eletrostático tão negativo e possuem uma estrutura estável. Quatro outros sistemas ternários, o alumínio(III):adenosina 5-trifosfato:homocisteína, o alumínio(III):fosfocreatina:homocisteína, o alumínio(III):adenosina 5-trifosfato: penicilamina e o alumínio(III):fosfocreatina:penicilamina, foram examinados apenas por potenciometria. Ela mostrou a ocorrência de várias reações de complexação e diversos complexos são formados de acordo com o pH. Comumente, o alumínio(III) se torna insolúvel entre pH 2,5 a 5,5. Todavia, isso não ocorreu. Os resultados exibiram a variedade do comportamento dos ligantes na complexação com o íon alumínio. As pesquisas sugerem como podem estar formados alguns complexos nos organismos vivos. / [en] This thesis investigated complexation reactions between aluminum(III) and ligands such as adenosine 5-triphosphate, phosphocreatine and amino acids by potentiometry, Raman spectroscopy and theoretical calculations in aqueous solution, with the aim to know the proprieties of formed complexes. The study was important to improve the knowledge about absorption mechanisms and bioavailability of aluminum(III). This learning could help clinical researches about prevention and treatment of neurodegenerative diseases. Aluminum is present in water and in vegetables, animal products and food additives. Parenteral nutrition solutions, infant formulas and medications also contain aluminum. In fluids, di- and triphosphate nucleosides and amino acids are good ligands for aluminum(III). Low molecular mass biomolecules form complexes which increase the pH of precipitation of the metal ion and its gastrointestinal absorption. This study analyzed six complexes with aluminum ions in aqueous solution. The binary compounds tetraaquaadenosine 5-triphosphate aluminum(III) and aquaphosphocreatine aluminum(III) were studied by Raman spectroscopy and quantum mechanical calculations. The analysis of the ternary complexes adenosine5-triphosphatediaquacysteine aluminate(III), adenosine5’- triphosphatetriaquamethionine aluminate(III), aquacysteinephosphocreatine aluminate(III) and aquaphosphocreatinemethionine aluminate(III) also involved potentiometry. Computational calculations used density functional theory with the hybrid functional B3LYP and the 6-311++G(d,p) basis set regarding water solvent effects by the polarizable continuum model. They included the assessment of geometrical parameters, Raman spectrum calculations and the description of electrostatic potential contour surfaces and mapped electrostatic potential. Regarding the binary complexes, analyses confirmed the bidentate behavior of adenosine 5-triphosphate through one oxygen of the phosphate beta and one oxygen of the phosphate gamma. In the complex that formed between aluminum(III) and phosphocreatine, the ligand behaved as a tridentate, coordinated through one oxygen in the phosphate, one oxygen in the carboxylate and one nitrogen in the guanidine group. The electrostatic potential maps pointed out the presence of neutral regions around atoms and, as the total charge of these molecules was zero, they should be soluble in lipids. In the ternary complexes, the coordination modes of adenosine 5-triphosphate and phosphocreatine adopted in binary compounds remained. Cysteine behaved as a bidentate ligand through one carboxylate oxygen and nitrogen. In the adenosine5- triphosphatetriaquamethionine aluminate(III) species, methionine acted as a monodentate ligand via the carboxylate oxygen. Despite the negative net charge of the complexes, they did not exhibit a negative electrostatic potential and had stable structures. The four other ternary systems, aluminum(III):adenosine 5- triphosphate:homocysteine, aluminum(III):phosphocreatine:homocysteine, aluminum(III):adenosine 5-triphosphate:penicillamine and aluminum(III): phosphocreatine:penicillamine, were examined only by potentiometry. The results showed the occurrence of various complexation reactions, and several complexes are formed depending on the pH. Commonly, aluminum(III) becomes insoluble between pH 2.5 to 5.5. However, this did not occur. These results bring to light the multiplicity of ligand behaviors in complexation with aluminum(III). This research also suggests that some complexes may be formed in living organisms.

En un intento de optimizar el sistema de fecundación in vitro en la especie porcina se estudió la influencia de distintas condiciones de maduración y de cocultivo de los gametos. Se evaluó la reducción del tiempo de coincubación de los gametos a 10 min observándose un claro efecto del ratio espermatozoides:ovocito. El estudio de las necesidades de los espermatozoides en términos de aditivos del medio de fecundación y tiempo de coincubación reveló variaciones entre verracos. La utilización de un tiempo de coincubación tan corto como 2 min fue suficiente para obtener unas tasas de penetración y monospermia similares a las alcanzadas por los sistemas de FIV tradicionales. El sistema de FIV en pajuela con 10 min de coincubación aumentó la penetración monoespérmica y mejoró la calidad de los blastocistos. La adición de 5 nM de 9- cis ácido retinoico al medio de maduración aumentó significativamente la formación de blastocistos. / The present study was conducted in an attempt to optimize porcine in vitro fertilization system. For this purpose, the influence of maturation and gamete coculture conditions were studied. The coincubation time may be reduced to 10 min to increase the efficiency of fertilization depending on the sperm:oocytes ratio. The needs of boar spermatozoa for IVF, in terms of additives to IVF medium and coincubation times vary among boars. The use of coincubation time as brief as 2 min is long enough to obtain good fertilization rates similar to those achieved from current long term exposure times in IVF. A straw IVF system in combination with a 10 min coincubation increased monospermic penetration and the quality of blastocysts compared with the microdrop-IVF system. The addition of 5 nM of 9- cis retinoic acid in the IVM medium increased blastocyst formation rate, suggesting that RA may play an important role during IVM.

Que o envenenamento pela serpente Bothrops jararaca causa distúrbios hemorrágicos sistêmicos, com alteração da coagulação e fibrinólise sangüíneas, é notório. Contudo, pouco se sabe sobre a ação in vivo desse veneno sobre as plaquetas. Em estudos recentes, demonstrou-se que esse veneno causa trombocitopenia, distúrbios da agregação e diminuição do número de corpos densos plaquetários, que, dessarte, sugeriam a ativação das plaquetas circulantes. Com o escopo de comprovar esta hipótese e melhor caracterizar as ações in vivo desse veneno sobre as plaquetas, serviu-se de um modelo experimental que empregava coelhos para o envenenamento pela B. jararaca. No grupo experimental, os animais foram injetados i.v. com o veneno da B. jararaca (60 µg/kg) e no grupo controle com salina. Previamente à administração de salina ou veneno, os coelhos tiveram suas plaquetas marcadas ex vivo com NHS-biotina. Para a avaliação das alterações plaquetárias, amostras de sangue foram coletadas seqüencialmente, em intervalos de tempo que variaram de 1 a 144 horas após a administração do veneno ou salina. Durante o envenenamento, houve trombocitopenia, hipofibrinogenemia, elevação dos níveis plasmáticos do fator de von Willebrand, diminuição da função plaquetária no sangue total induzida pela botrocetina e pelo colágeno e diminuição da secreção de ATP. Não obstante, os níveis plasmáticos de fator plaquetário 4, um marcador específico da ativação plaquetária in vivo, e os níveis intraplaquetários de serotonina se mantiveram constantes. Pela citometria de fluxo, observou-se um decréscimo significativo da expressão do epítopo da GPIIb-IIIa reconhecido pelo anticorpo monoclonal P2, porém isso não foi observado ao utilizar-se anticorpos policlonais. A expressão de fibrinogênio ou dos produtos de degradação do fibrinogênio/fibrina (PDF) na membrana plaquetária também não sofreu alteração significativa ao longo do tempo. Houve, todavia, elevações significativas da P-selectina plaquetária, um receptor cuja expressão é indicativa de ativação plaquetária, e do epítopo induzido por ligantes (LIBS1) da GPIIIa. A porcentagem de plaquetas reticuladas na circulação, assim como os tempos de sobrevivência plaquetária, não foram estatisticamente diferentes entre os dois grupos. As análises histológicas e imuno-histoquímicas dos órgãos dos coelhos mostraram que as plaquetas circulantes são retidas entre redes de fibrina nos capilares pulmonares. Os resultados obtidos sugerem que a trombina engendrada pelos componentes pró-coagulantes deste veneno desempenha uma função essencial na patogenia dos distúrbios da coagulação e plaquetários observados neste modelo de envenenamento. O aumento da expressão de P-selectina no grupo experimental comprovou a hipótese inicial de que as plaquetas dos coelhos envenenados são verdadeiramente ativadas na circulação. Os dados ora apresentados demonstram definitivamente que a diminuição do fibrinogênio ou o aumento dos PDF não são a causa fundamental da disfunção plaquetária observada no envenenamento botrópico e que outro(s) composto(s) parece(m) estar envolvido(s) com estes distúrbios plaquetários. / In spite of being well established that Bothrops jararaca snake venom causes blood coagulation and fibrinolysis disturbances in patients, scant information about blood platelet disorders during envenomation is available. In recent investigations, thrombocytopenia, platelet aggregation disturbances and decreased numbers of platelet dense bodies were observed following venom administration, suggesting that circulating platelets had been activated. In order to prove this hypothesis and to gain a better characterization of the in vivo role of this venom on platelets, an experimental model of B. jararaca envenomation was utilized. Rabbits were injected i.v. either with B. jararaca venom (60 µg/kg) (experimental group) or saline (control group). Previously to saline or venom administration, rabbit platelets were labeled ex vivo with NHS-biotin. To evaluate platelet disturbances, blood samples were collected consecutively, at time intervals that varied from 1 to 144 hours after venom or saline administration. During envenomation, there were thrombocytopenia, hypofibrinogenemia, elevation of von Willebrand factor plasma levels, reduced botrocetin- and collagen-induced platelet aggregation in whole blood, and decreased ATP secretion. However, plasma levels of platelet factor 4, a specific marker of in vivo platelet activation, and intraplatelet serotonin levels remained constant. By flow cytometry, a significant decrease on the expression of GPIIb-IIIa epitope recognized by P2 monoclonal antibody was observed; however, this was not observed when polyclonal antibodies were employed. Fibrinogen or fibrin(ogen) degradation product (FDP) expression on platelet surface showed no significant alteration. Nonetheless, significant elevations of platelet P-selectin, a receptor whose expression is indicative of platelet activation, and of ligand-induced binding sites (LIBS1) of GPIIIa were noted. The percentage of circulating reticulated platelets, as well as platelet survival times, were not statistically different between the two groups. Histopathological and immunohistochemical analyses of rabbit organs demonstrated that circulating platelets were sequestered among fibrin deposits in pulmonary capillaries. These results suggest that thrombin generated by procoagulating components of B. jararaca venom has an essential role in the pathogenesis of platelet and coagulation disorders in this experimental model. Increased expression of P-selectin in the experimental group proves the initial hypothesis that platelets of envenomed rabbits are indeed activated in the circulation. The data presented herein demonstrate definitively that decreased fibrinogen or increased FDP levels are not the primary cause of the platelet dysfunction observed in bothropic envenomation, but other substances seem to be responsible for it.