As integrinas são proteínas de membrana envolvidas em diversos processos biológicos como embriogênese, inflamação e agregação plaquetária. A alteração de seu padrão de expressão está relacionada com processos patológicos como trombose e câncer, fazendo das integrinas ótimos indicadores da progressão destas doenças. Assim, a integrina α2β1 pode ser considerada como indicadora de angiogênese, sendo expressa nas células endoteliais durante o crescimento de novos vasos. Já a ausência da αIIbβ3 em plaquetas está relacionada com a doença de Glanzmann, caracterizada por uma agregação plaquetária deficiente, e sua presença em outros tipos celulares está relacionada com processos de metástase e invasão de tecidos. Estas integrinas contêm antagonistas naturais nos venenos de serpentes da família VIPERlDAE: As RGD-disintegrinas bloqueiam a integrina αIIbβ3 e as ECD-disintegrinas bloqueiam a integrina α2β1. Estas últimas formam parte de metaloproteinases com múltiplos domínios de aproximadamente 50 kDa. Interessados em desenvolver marcadores moleculares para estas integrinas, direcionamos nossos objetivos para: (1) a elucidação da região mínima das ECD-disintegrinas com atividade biológica e (2) construção de biomarcadores para a integrina α2β1 utilizando a região elucidada, e para a integrina αIIbβ3 utilizando uma RGD-disintegrina. Neste trabalho conseguimos determinar uma região de 49 resíduos na porção C-terminal do domínio ECD-disintegrina da jararagina que reage com um anticorpo neutralizante das atividades hemorrágica e de ligação ao colágeno da proteína. Esta região foi subclonada e expressa em fusão com a fosfatase alcalina de E. colí, mas não teve funcionalidade como marcador. No entanto, a RGD-disintegrina eristostatina em fusão com a fosfatase alcalina mostrou bifuncionalidade, apresentando tanto atividade disintegrina como atividade catalítica. Além disso, verificamos sua seletividade pela integrina αIIbβ3 e padronizamos um ensaio direto de dot blot para a presença dessa integrina em plaquetas, com um único passo de incubação. / Integrins are membrane proteins involved in biological processes such as embriogenesis, inflammation and platelet aggregation. The alteration of their expression pattem is related to pathological disorders such as thrombosis and cancer, making integrins suitable indicators of the progression of these diseases. Thus, the α2β1 integrin, which is expressed in endothelial cells during capillary growth, may be an indicator of angiogenesis. The absence of αIIbβ3 integrin in platelets is related to Glanzmann disease, characterized by defective platelet aggregation and its expression in other cellular types is related with metastasis and tissue-invasion processes. These integrins contain natural antagonists in venoms from the VIPERIDAE snake family: RGD-disintegrins, which block the αIIbβ3 integrin and ECD-disintegrins, which block the α2β1 integrin. The latter forming part of multidomain metalloproteinases of approximately 50 kDa. In order to develop molecular markers for integrins, we have directed our objectives at: (1) determining the minimal region of ECD-disintegrins with biological activity and (2) engineering biomarkers for the α2β1 integrin using the previously determined minimal region and for the αIIbβ3 using an RGD-disintegrin. In this work we have determined a 49-residue region located in the C-terminus of jararhagin ECD-disintegrin domain, which reacts with a neutralizing antibody of hemorrhagic and binding to collagen activities of the protein. This region was subcloned and expressed in fusion with E. coli alkaline phosphatase, but did not present a marker activity. On the other hand, the RGD-disintegrin eristostatin fused to alkaline phosphatase showed bifunctionality, presenting both, disintegrin and catalytic activities. Furthermore, we have characterized its selectivity for the αIIbβ3 integrin and we have standardized a direct dot blot assay with one-step incubation for the presence of this integrin in platelets.

O câncer de próstata é o quinto tipo mais comum de câncer no mundo e o mais comum em homens. Fatores clínicos e anatomopatológicos atualmente usados na clínica não são capazes de distinguir entre a doença indolente e a agressiva. Existe uma grande necessidade de novos marcadores de prognóstico, a fim de melhorar o gerenciamento clínico de pacientes de câncer de próstata. Além das anormalidades em genes codificadores de proteínas, alterações em RNAs não codificadores (ncRNAs) contribuem para a patogênese do câncer e, portanto, representam outra fonte potencial de biomarcadores de câncer de próstata. Entretanto, até o momento, poucos estudos de perfis de expressão de ncRNAs foram publicados. Este projeto teve como principal objetivo identificar perfis de expressão de genes codificadores e não codificadores de proteína correlacionados com recorrência de tumor de próstata, a fim de gerar um perfil prognóstico com potencial uso como biomarcadores e elucidar o possível papel de ncRNAs no desenvolvimento do câncer. Para isso, foram analisados os perfis de expressão de genes codificadores e não codificadores de proteína de um conjunto de 42 amostras de tecido tumoral de câncer de próstata de pacientes de amostras de pacientes submetidos à prostatectomia radical, com longo acompanhamento clínico (cinco anos) e conhecida evolução da doença Nós utilizamos microarranjos por nós desenhados e fabricados pela Agilent sob encomenda, interrogando aproximadamente 18.709 transcritos não codificadores longos (>500 nt), sem evidência de splicing, que mapeiam em regiões intrônicas dentro de 5.660 loci genômicos. Os dados de expressão foram extraídos de cada arranjo, normalizados entre todas as 42 amostras de pacientes. Usando uma estratégia de múltipla amostragem, foi identificado um perfil de expressão de mau prognóstico, contendo 51 transcritos intrônicos não codificadores de proteína. O perfil prognóstico de ncRNAs foi aplicado a um conjunto teste independente de 22 pacientes, classificando corretamente 82% das amostras. Uma análise de Kaplan-Meier dos pacientes do conjunto teste indicou que as curvas de sobrevida dos grupos de alto e baixo risco foram significativamente distintas (Log-rank test p = 0,0009; Hazard ratio = 23,4, 95% CI = 3,62 a 151,2), confirmando assim que este classificador é útil para identificar pacientes com alto risco de recorrência. Além disso, estas descobertas indicam um potencial papel destes RNAs intrônicos não codificadores na progressão do tumor de próstata e apontam para os RNAs intrônicos como potenciais novos marcadores de câncer / Prostate cancer is the fifth most common type of cancer in the world, and the most common in men. Clinical and anatomo-pathological factors currently used in clinic are not able to distinguish between the indolent and the aggressive disease. There is a major need of new prognostic makers in order to improve the clinical management of prostate cancer patients. Apart from abnormalities in protein-coding genes, changes in non-coding RNAs (ncRNAs) contribute to the pathogenesis of cancer and thus represent another potential source of prostate cancer biomarkers. However, few studies of expression profiles of ncRNAs have been published. This project aimed to identify expression profiles of protein-coding and non-coding genes correlated to prostate cancer biochemical recurrence. For this, we analyzed the expression profile of 42 prostate cancer samples from patients undergoing radical prostatectomy, with long follow-up (five years), and know disease outcome. We used a custom microarray designed by us and printed by Agilent, that probes 18,709 long (>500 nt) ncRNAs mapping to intronic regions within 5,660 genomic loci. The expression data were extracted from each array and normalized across all 42 samples. Using a multiple random sampling validation strategy, we identified an expression profile of poor prognosis, comprising 51 ncRNAs. The prognostic profile of ncRNAs was applied to an independent test set of 22 patients, correctly classifying 82% of the samples. A Kaplan-Meier analysis of the test set of patients indicated that the survival curves of high and low risk groups were significantly different (Log-rank test p = 0.0009, Hazard ratio = 23.4, 95% CI = 3.62 to 151.2) thus confirming that this classifier is useful for identifying patients at high risk of recurrence. Furthermore, these findings indicate a potential role of these intronic non-coding RNAs in the progression of prostate tumors and points to the intronic ncRNAs as potential new markers of cancer.

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:56:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ANA CLAUDIA AMBIEL_Dissertacao Agro.pdf: 1588101 bytes, checksum: 47a54fc705f03fc7d27cd4e4abfdb183 (MD5) Previous issue date: 2007-07-18 / The aim of this work was the determination of intra and intergenetic similarity between three Brachiaria species among germplasm accesses and commercial materials throughout RAPD markers. Seeds were used as DNA source. 10 decamers primers were selected between 120 primers assayed and 107 polymorphic bands were used to perform the molecular variance analysis (AMOVA), Jaccard similarity and species fixation index. 24.4% of the total variability was contained between species and 75.6% inside the species, with a species fixation index (FST) of 0.24. The tree showed that two major branches were formed, one with the three outgroup species and other with the species, this one split in three minor branches one with all B. ruziziensis samples; other with all B. decumbens accessions and three of B. brizantha and the last with two B. brizantha accesses, all commercial cultivars and B. decumbens cv. Basilisk . It was possible to group, throughout RAPD, Brachiaria accesses and cultivars. The genetic variability index between species was considered low and somehow low when faced with autogamous species. B.brizantha showed the highest genetic variability and the lowest FST what means that there is a higher genetic flux intra specific than the others. / O propósito deste trabalho foi determinar a similaridade genética de entre acessos de germoplasma e cultivares comerciais três espécies de Brachiaria (inter e intraespecífica), através de marcadores RAPD. Sementes foram utilizadas como fonte de DNA. 10 primers decâmeros foram selecionados de 120 primers avaliados, produzindo 107 bandas polimórficas, as quais foram utilizados para a análise de variância molecular (AMOVA), o coeficiente de similaridade de Jaccard e índices de fixação gênica. 24,40% da variabilidade genética total está contida entre as espécies e 75,60% dentro destas, com índice de fixação gênica (FST) 0,24. No dendrograma houve a formação de dois ramos, um formado por P. maximum e B. arrecta e o outro subdividido em três: todas amostras de B. ruziziensis; todos os acessos de B. decumbens e três acessos de B. brizantha e o último com dois acessos de B. brizantha mais as B. brizantha comerciais e a B. decumbens cv Basilisk . Foi possível agrupar os acessos e cultivares de Brachiaria através de RAPD. O índice de variabilidade genética entre espécies foi considerado baixo, sendo inferior a valores determinados em algumas espécies autógamas. B. brizantha apresenta maior variabilidade genética e menor FST indicando maior fluxo gênico intra-específico do que as outras.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:51:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ANA CLAUDIA AMBIEL_Dissertacao Agro.pdf: 1588101 bytes, checksum: 47a54fc705f03fc7d27cd4e4abfdb183 (MD5) Previous issue date: 2007-07-18 / The aim of this work was the determination of intra and intergenetic similarity between three Brachiaria species among germplasm accesses and commercial materials throughout RAPD markers. Seeds were used as DNA source. 10 decamers primers were selected between 120 primers assayed and 107 polymorphic bands were used to perform the molecular variance analysis (AMOVA), Jaccard similarity and species fixation index. 24.4% of the total variability was contained between species and 75.6% inside the species, with a species fixation index (FST) of 0.24. The tree showed that two major branches were formed, one with the three outgroup species and other with the species, this one split in three minor branches one with all B. ruziziensis samples; other with all B. decumbens accessions and three of B. brizantha and the last with two B. brizantha accesses, all commercial cultivars and B. decumbens cv. Basilisk . It was possible to group, throughout RAPD, Brachiaria accesses and cultivars. The genetic variability index between species was considered low and somehow low when faced with autogamous species. B.brizantha showed the highest genetic variability and the lowest FST what means that there is a higher genetic flux intra specific than the others. / O propósito deste trabalho foi determinar a similaridade genética de entre acessos de germoplasma e cultivares comerciais três espécies de Brachiaria (inter e intraespecífica), através de marcadores RAPD. Sementes foram utilizadas como fonte de DNA. 10 primers decâmeros foram selecionados de 120 primers avaliados, produzindo 107 bandas polimórficas, as quais foram utilizados para a análise de variância molecular (AMOVA), o coeficiente de similaridade de Jaccard e índices de fixação gênica. 24,40% da variabilidade genética total está contida entre as espécies e 75,60% dentro destas, com índice de fixação gênica (FST) 0,24. No dendrograma houve a formação de dois ramos, um formado por P. maximum e B. arrecta e o outro subdividido em três: todas amostras de B. ruziziensis; todos os acessos de B. decumbens e três acessos de B. brizantha e o último com dois acessos de B. brizantha mais as B. brizantha comerciais e a B. decumbens cv Basilisk . Foi possível agrupar os acessos e cultivares de Brachiaria através de RAPD. O índice de variabilidade genética entre espécies foi considerado baixo, sendo inferior a valores determinados em algumas espécies autógamas. B. brizantha apresenta maior variabilidade genética e menor FST indicando maior fluxo gênico intra-específico do que as outras.

La regeneración de plantas a partir de explantes es la base de partida para poder aplicar tecnologías tales como la obtención de plantas haploides o la transformación genética. Este carácter presenta una amplia variabilidad inter e intraespecífica. Así, incluso dentro de la misma especie, podemos encontrarnos genotipos recalcitrantes cuya falta o escasa regeneración limita la aplicación de estas técnicas. Además del componente genético, otros factores que condicionan el éxito de la regeneración son: las condiciones fisiológicas del material de partida, los componentes del medio de cultivo, los reguladores de crecimiento, la temperatura, la luz, etc¿ La falta de información acerca de qué factores determinan que este proceso se produzca por una u otra vía morfogenética (la vía organogénica o la embriogénica) y la incertidumbre de cuantos genes están implicados, indica la necesidad de investigación básica de este proceso. El objetivo principal de este trabajo se centra en incrementar el conocimiento de la base genética así como la localización de QTLs implicados en la regeneración por la vía organogénica que es la predominante en tomate. Para ello, se han utilizado dos poblaciones de mapeo (F2, BC1) obtenidas por la Dra. Gisbert. La población F2 se obtuvo a partir de la autofecundación de una planta F1, resultante del cruce de una planta de tomate (S. lycopersicum L.) seleccionada por su escasa capacidad regenerativa (Anl27) y la accesión PE-47 de S. pennellii Correll. con alta capacidad de regeneración. Por su parte, la población BC1 se obtuvo a partir del cruce (Anl27 x F1). Con estos materiales se ha realizado una caracterización fenotípica y genotípica en clones de cada genotipo, que se han mantenido en cultivo in vitro. Utilizando el programa informático MapQTL¿ se han identificado seis QTL implicados en la regeneración localizados en los cromosomas 1, 3, 4, 7 y 8. Cinco de los QTLs (SpRg-1, Rg-3, SpRg-4a, SpRg- 4b, SpRg-7) proceden del tomate silvestre S. pennellii y uno (SlRg-8) procede de S. lycopersicum. El porcentaje de varianza explicada por cada QTL va desde el 7,4% al 27%, dentro del rango común (6-26%) registrado en el mapeo genético de QTLs relacionados con la regeneración in vitro en otros cultivos. SpRg-1 es el mayor responsable de la respuesta morfogenética mientras que SpRg-7 promueve el desarrollo del brote hacia una planta completa. Por otra parte los QTLs detectados en los cromosomas 8 (SlRg-8) y 4 (SpRg-4a, SpRg-4b) podrían contener genes que influyen en la formación de yemas y su desarrollo, respectivamente. Finalmente Rg-3, situado en la mitad del cromosoma 3 y ligado al gen de la invertasa ácida, se presenta como un alelo putativo del gen Rg detectado en S. peruvianum (Rg-1) y S. chilense (Dunal) Reiche. (Rg-2). Además del genotipo, el tipo y combinación de reguladores de crecimiento son importantes para el éxito de los protocolos de regeneración. En tomate, los reguladores de crecimiento más utilizados son las citoquininas, o la combinación de estas con auxinas. Otros reguladores como el etileno se han estudiado poco y los trabajos publicados muestran conclusiones dispares. Con el fin de estudiar la influencia del etileno en la regeneración se han realizado ensayos con dos compuestos liberadores de etileno (Ácido 1-aminociclopropano-1- carboxílico ¿ACC¿ y ácido 2-Cloroetil fosfónico ¿Ethephon¿) y dos inhibidores de etileno: AgNO3, que inhibe la acción del etileno; y CoCl2, que inhibe la producción de etileno. Los resultados obtenidos muestran que la concentración y el momento de la aplicación son dos factores fundamentales a tener en cuenta para el éxito de la respuesta organogénica. En concreto, la aplicación de inhibidores de etileno y su consecuente disminución tiene un efecto negativo sobre la regeneración en tomate ya que se disminuye y se retrasa la respuesta. Así mismo, las plantas regenerantes obtenidas presentan tamaño reducido, pudiendo aparecer vitrificación y malformaciones. Por otra parte, la suplementación de etileno puede mejorar la regeneración. Así, el número de plantas regeneradas a partir de explantes de S. pennellii se duplicó en los medios con ACC respecto al medio control. Si la aplicación de ACC se realiza tras la inducción de las yemas, pasados 10 días, el rendimiento total será mayor. Este resultado indica que éste compuesto podría ser utilizado para mejorar la regeneración en aquellos genotipos donde una vez formadas las yemas, el desarrollo de estas hacia plantas es el paso limitante. Por otra parte, las plantas regenerantes obtenidas muestran buen desarrollo, por lo que la suplementación de etileno no afecta al posterior crecimiento de las plantas regeneradas. Finalmente se ha estudiado la capacidad organogénica de las especies silvestres de tomate derivadas del complejo S. peruvianum L. sensu lato (s.l.): Solanum arcanum Peralta., Solanum huaylasense Peralta., Solanum corneliomulleri J. F. Macbr. y Solanum peruvianum L. sensu stricto (s.s.). Estas especies pueden tener un papel fundamental en la mejora, sobre todo de resistencias a factores bióticos. Sin embargo, debido a las barreras de hibridación que existen entre éstas y el tomate cultivado, no se han explotado en su totalidad en la mejora del cultivo. Para realizar cruces se ha recurrido a la fusión de protoplastos y el rescate de embriones. Sin embargo, no se ha estudiado la capacidad organogénica de las especies derivadas del complejo Peruvianum, lo que limita la aplicación de estas técnicas. En este trabajo se ha encontrado variabilidad intra e interespecífica en la capacidad organogénica de las especies silvestres derivadas de este complejo. En general, todas las accesiones ensayadas de S. corneliomulleri y S. huaylasense mostraron una elevada capacidad regenerativa y se han identificado accesiones recalcitrantes en S. arcanum (LA-2185) y S. peruvianum s.s (ECU-106 y CH-20). En este trabajo, también se ha realizado un análisis morfológico de las hojas que ha determinado que el número de foliolos y el nivel de dentición de los mismo pueden ser utilizados en la identificación in vitro de las especies del complejo. Sin embargo, el área de foliolo solo permite distinguir a S. arcanum del resto de especies del complejo. Finalmente se ha observado que las accesiones cuyas hojas tienen mayor número de foliolos y mayor nivel de dentición tienen una mayor regeneración. / Trujillo Moya, C. (2013). Estudio de la Capacidad Organogénica en tomate y especies relacionadas: Localización de QTLS implicados y estudio de la influencia del Etileno [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/31665

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:24:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ANGEL jose.pdf: 1885350 bytes, checksum: 8203e3220392d36d98c1cc30c0439590 (MD5) Previous issue date: 2005-08-30 / The araticunzeiro (Annona crassiflora Mart.) is a tropical fruit tree species from the Cerrado (Brazilian Savannah) with high economic potential. The strong degradation of the Cerrado, allied to the predatory extractivism that threatens the species, points out to the necessity of development of research to support future conservation programs. With the aim to furnish information about the genetic status of this species and to guide future conservation strategies, 82 individuals from 11 natural populations were submitted to genetic analysis. The coalescent based analysis of the polymorphism present in the trn-L cpDNA allowed the detection of high levels of genetic diversity in the species. In spite of the high level of genetic similarity among different populations the results produced suggested that, , there is an incipient, but statistically significant, increasing differentiation process taking place due to current status of geographical isolation and genetic drift. The genetic differentiation coefficient estimated was equal to 7.3%. The spatial genetic divergence analyses suggested that the genetic distances are not associated to geographical distances between populations, evidencing the absence of current gene flow between adjacent populations. The coalescent based approach allowed the identification of different evolutionary scenes to the investigated populations. Among sampled populations cases from well conserved status to dangerous low levels of genetic diversity were detected. Results obtained by the use of coalescent models to infer the divergence time between populations suggested that natural populations of A. crassiflora were, until recently, part of a great regional continuum. These findings suggest that the low levels of genetic diversity among different populations must be due to the small time since isolation. / O araticunzeiro (Annona crassiflora Mart.) é uma espécie de árvore frutífera nativa do bioma Cerrado com elevado potencial de utilização econômica. A forte degradação desse bioma, aliada ao extrativismo predatório a que a espécie vem sendo submetida, justifica a necessidade de desenvolvimento de pesquisas que subsidiem a sua conservação. Objetivando obter informações que indiquem o status genético dessa espécie e orientem futuras estratégias de conservação, 82 indivíduos provenientes de 11 populações naturais foram analisados geneticamente. A análise do polimorfismo presente em seqüências da região trn-L do genoma cloroplastidial e posterior aplicação dos modelos associados à teoria da coalescência permitiram a detecção de elevados níveis de diversidade genética para a espécie. Os resultados obtidos indicam que, embora as populações amostradas tenham demonstrando elevada similaridade genética entre si, há uma incipiente, mas significativa, diferenciação genética entre elas, que tende a aumentar progressivamente devido ao efeito do isolamento geográfico e à força da deriva. O coeficiente de diferenciação genética entre as populações analisadas foi de 7,3%. A análise de divergência entre as populações amostradas não evidenciou a existência de associação significativa dos padrões de diferenciação genética com a distância geográfica entre elas. As informações obtidas pela análise baseada no modelo de coalescência permitiram a identificação de diferentes cenários evolutivos para as populações estudadas. Dentre as populações amostradas, foram identificadas desde populações em bom estado de conservação até populações com baixíssimos níveis de diversidade genética. Os resultados obtidos pela utilização do modelo coalescente para se inferir o tempo de divergência entre as populações sugeriram que as populações se A. crassiflora até há muito pouco tempo se constituíam em um grande contínuo populacional, sendo a baixa diversidade encontrada entre as populações atribuída ao pequeno tempo de divergência entre elas.

Made available in DSpace on 2014-07-29T14:52:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE LUICE gomes.pdf: 3188724 bytes, checksum: c4156187d61efe808b3d021846f674dd (MD5) Previous issue date: 2010-08-31 / The plant genetic resources stored ex situ are considered as a genetic repository, and are raw material for the development of the world agriculture. In rice, despite its high genetic variability, the lack of information of accessions to compose a databank prevents its use to help the choice of genitors for the breeding programs. The Embrapa Rice Core Collection (ERiCC) was developed from 10,000 accessions from Embrapa GeneBank, and it was set up by 550 accessions, divided in three subsets: 1) 94 lines and cultivars from Brazil (LCB); 2) 148 lines and cultivars from abroad (LCI); and 3) 308 traditional varieties (VT), obtained from germplasm collection expeditions in Brazil. This work aimed: 1) to evaluate the extension of genetic variability of 550 accessions from ERiCC by means of agronomic traits characterization using mixed models and multivariate statistics; 2) to perform a comparative analysis of the genetic divergence considering the agronomical and SSR markers characterizations; and 3) to identify the genotypes with higher genetic diversity and with the best agronomic performances, aiming to promote the most efficient use of such germplasm in breeding programs. The agronomic characterization of 550 accessions was performed in nine field experiments, evaluating 18 phenological-agronomic traits. The data were analyzed using the mixed linear and AMMI models. There was wide variation range of genotypical values for most evaluated traits. In different environments, it was observed VT accessions among the high-yielding materials, demonstrating the potential of this group of germplasm, particularly important due to its high genetic variability, to contribute to the development of cultivars regionally adapted. The AMMI approach allowed a good discrimination of ERiCC rice genotypes in relation to the adaptive performance, identifying the accessions CA880078, CA990001, CA870071 (subset VT), and CNA0009113 (LCI) as having good yield and broad adaptation to distinct environments. The comparative analysis of genetic diversity between agronomic and molecular data was performed using the 242 lines and cultivars accessions from ERiCC, which were characterized by 86 fluorescent SSR markers, and five agronomic traits with genotypic values predicted (values without from the effects of interaction genotypes x environment, from a joint analysis of nine experiments. The genetic divergence among accessions was estimated by the average Euclidian distance for phenotypical data, and by the Rogers modified by Wright (RW) genetic distance. The datasets were jointly analyzed by descriptive and multivariate statistics, using correlation analyses from hierarchical grouping of Ward and UPGMA methods. The phenotypical and molecular data showed a broad distribution of dissimilarity indexes, despite they showed different patterns of variation between them. Low molecular distances were associated to low phenotypical distances, however to high molecular distances, occurred a high broad range of phenotypical variation. The correlation between genetical and phenotypical dissimilarities was significant for both lowland and upland accessions, despite with different values (r=0.156 and r=0.409, respectively). Due to the low relation between phenotypical and molecular data, the analysis of genotypes to be used in breeding programs must include both evaluations to a better accession characterization. Considering the high yielding accessions, the higher molecular distances were identified among the accessions from lowland system of cultivation, among which BR IRGA 413 and CNA0005014, BR IRGA 413 and CNA0005853, and CNA0004552 and CNA0005014. Considering the upland accessions, maximum genetic distances were identified in CNA0000482 and CNA0006422, CNA0001006 and CNA0006422, and CNA0001006 and CNA0003490. The molecular analysis was able to identify accessions with reduced genetic relationship, that if used as genitors, will result in a progeny with a high probability to find new allelic combinations. On the other hand, the phenotypical characterization is important to identify accessions not just genetically divergent, but with superior agronomic trait performances for breeding programs. The results of this work will permit to increase the activities related to the characterization of accessions from rice Genebank, giving support of breeding programs to choose the best accessions to obtain new cultivars, with favorable traits, and broad genetic basis. In addition, a continuous program of phenotypical and molecular characterization of germplasm will be able to identify accessions to increase the genetic variability of ERiCC. / Os recursos genéticos vegetais armazenados ex situ são considerados reservatórios de genes e funcionam como matéria-prima para o desenvolvimento da agricultura mundial. Na cultura do arroz, apesar da extensa variabilidade genética existente, a deficiência de informações que integrem dados que possam efetivamente auxiliar na escolha de genótipos importantes para os programas de melhoramento constitui o principal fator que limita a utilização mais ampla dos acessos armazenados nos bancos de germoplasma. A Coleção Nuclear de Arroz da Embrapa (CNAE) representa a variabilidade genética de mais de 10 mil acessos constituintes do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) da Embrapa Arroz e Feijão, e é composta por 550 acessos subdivididos em três estratos: 1) 94 Linhagens e Cultivares Brasileiras (LCB), provenientes de programas de melhoramento de instituições brasileiras; 2) 148 Linhagens e Cultivares Introduzidas (LCI), provenientes de programas de melhoramento de outros países; e 3) 308 Variedades Tradicionais (VT), que reúne acessos obtidos por expedições de coleta de germoplasma realizadas em vários estados do Brasil. Este trabalho teve como principais objetivos: 1) avaliar a extensão da variabilidade genética dos 550 acessos pertencentes à CNAE por meio da caracterização agronômica via metodologias de modelos mistos e estatísticas multivariadas; 2) realizar a análise comparativa da divergência genética entre acessos, determinada pela avaliação de caracteres agronômicos e marcadores moleculares SSR; e 3) identificar os genótipos com maior diversidade genética e com melhores atributos agronômicos, a fim de indicar uma melhor utilização destes recursos genéticos em programas de melhoramento. Na caracterização agronômica foram avaliados 550 acessos em experimentos conduzidos em nove locais no Brasil, envolvendo um total de 18 caracteres fenológico-agronômicos. Os dados foram analisados empregando-se a abordagem de modelos lineares mistos e modelo AMMI de análise. Verificou-se grande amplitude de variação dos valores genotípicos para a maioria dos caracteres avaliados. Nos diferentes ambientes, houve ocorrência de genótipos do estrato VT entre os mais produtivos, o que demonstra o potencial deste grupo de germoplasma, particularmente importante por sua grande variabilidade genética, em contribuir para o desenvolvimento de cultivares regionalmente adaptadas. A abordagem AMMI permitiu uma boa discriminação dos genótipos de arroz da CNAE quanto ao seu comportamento adaptativo, identificando os acessos CA880078, CA990001, CA870071 (do estrato VT), e CNA0009113 (LCI) com estabilidade, produtividade satisfatória e ampla adaptação à diferentes ambientes. Para a análise comparativa da diversidade genética entre dados agronômicos e moleculares foram considerados 242 acessos da CNAE, os quais foram caracterizados utilizando-se 86 marcadores SSR fluorescentes, sendo que para os dados agronômicos, foram realizadas análises conjuntas dos experimentos e considerados os valores genotípicos preditos de cinco caracteres (valores livres dos efeitos de interação genótipos x ambientes). A divergência genética entre os acessos foi estimada pelo procedimento de distância Euclidiana média para os dados fenotípicos, e por meio da distância de Rogers modificada por Wright (RW) para os dados moleculares, analisando-se os conjuntos de dados por meio de estatísticas descritivas e multivariadas, empregando-se análises de correlação entre matrizes de dissimilaridade e análises de agrupamento hierárquico de Ward e UPGMA. Os dados fenotípicos e moleculares apresentaram uma ampla distribuição dos índices de dissimilaridade, embora tenham apresentado diferentes padrões dessa variação. Baixas distâncias moleculares estiveram associadas a baixas distâncias baseada nos valores genotípicos, no entanto para elevadas distâncias moleculares houve ocorrência de ampla escala de variação fenotípica. A correlação entre as dissimilaridades genéticas e valores genotípicos foi significativa tanto no conjunto de acessos irrigados quanto no de sequeiro, porém, com diferentes magnitudes (r=0,156 e r=0,409, respectivamente). Devido esta baixa relação entre os dados fenotípicos e moleculares, o estudo de genótipos para fins de uso no melhoramento genético deve incluir ambas avaliações para a melhor caracterização dos acessos. Entre os materiais mais produtivos, as maiores distâncias moleculares foram identificadas entre os genótipos do sistema de cultivo irrigado, dentre eles BR IRGA 413 e CNA0005014, BR IRGA 413 e CNA0005853, e CNA0004552 e CNA0005014. Entre os materiais de sequeiro, máximas distâncias genéticas foram identificadas entre os acessos CNA0000482 e CNA0006422, CNA0001006 e CNA0006422, e CNA0001006 e CNA0003490. A análise molecular permitiu que fossem identificados genótipos de vínculo genético reduzido, que quando utilizados como parentais em cruzamentos, possibilitarão que as progênies obtidas apresentem maiores chances de combinações alélicas inéditas. Por sua vez, a caracterização fenotípica tem papel fundamental na identificação de materiais que além de divergentes, apresentem desempenho agronômico superior para os programas de melhoramento. Os resultados deste trabalho permitirão aumentar eficazmente as atividades relacionadas à caracterização de acessos do Banco Ativo de Germoplasma de arroz, subsidiando os programas de melhoramento na escolha de genótipos a serem utilizados para a obtenção de novas cultivares, com características favoráveis, de ampla base genética. Em adição, um programa contínuo de caracterização fenotípica e molecular de germoplasma permitirá ainda a escolha de acessos para a ampliação da variabilidade genética da CNAE.

O câncer de mama é o carcinoma que mais acomete mulheres no Brasil. Os tratamentos disponíveis são recomendados a partir da análise de fatores de prognóstico como a classificação pelo sistema TNM, tipo histológico, status de receptores hormonais e marcadores de proliferação tumoral. No entanto, a classificação dos tumores de mama é muito variável e o poder prognóstico dos marcadores tumorais atuais ainda é limitado, levando muitas pacientes à terapia adjuvante desnecessária. Portanto, novos métodos de prognóstico mais sensíveis são necessários para melhorar a tomada de decisão na clínica oncológica de pacientes com câncer de mama. Do ponto de vista de ciência básica, as modificações transcricionais associadas à oncogênese e progressão do câncer de mama ainda são pouco conhecidas. Além da alteração na expressão de genes codificadores para proteínas, evidências recentes sugerem que RNAs não-codificadores (ncRNAs) podem ter um papel importante na transformação maligna. Este projeto teve como principais objetivos: i) investigar a expressão de ncRNAs intrônicos em amostras de adenocarcinoma de mama e ii) identificar assinaturas de expressão gênica associadas a características anatomo-patológicas e clínicas de tumores de mama com potencial aplicação clínica. Para isso, foram comparados os perfis de expressão gênica de 58 amostras de tecido tumoral de mama, com seguimento clínico conhecido, utilizando uma plataforma de microarranjos de cDNA, enriquecida em ncRNAs provenientes de regiões intrônicas de genes humanos conhecidos. 9 Durante o projeto foram testadas diferentes metodologias para análise da expressão gênica utilizando microarranjos de cDNA com uma ou duas cores. O desenho experimental das hibridizações incluiu a co-hibridização de cada microarranjo com alvos fluorescentes representando o transcritoma da amostra de tumor juntamente com um oligonucleotídeo referência complementar a uma região presente em todas as sondas de cDNA (RefOligo). Este desenho experimental permitiu a avaliação de duas abordagens de análise da expressão gênica: a primeira baseada nas intensidades diretas de cada transcrito (One-Color) e a segunda baseada em razões de expressão onde a intensidade de cada transcrito foi normalizada pelo oligonucleotídeo referência (RefOligo). A utilização direta das intensidades se mostrou mais reprodutível e sensível para a detecção de assinaturas de expressão correlacionadas com características das amostras de mama, e essa abordagem foi escolhida para as análises subseqüentes. Os dados provenientes dos experimentos de microarranjos revelaram níveis de expressão ubíqüos dos transcritos intrônicos nas amostras analisadas, extendendo para o câncer de mama a relevância do estudo desta classe de ncRNAs. Além disso, foi identificada uma assinatura contendo 95 transcritos, correlacionada com o status de expressão do receptor de estrogênio (REr), dos quais cerca de 15% correspondem a ncRNAs. Utilizando apenas amostras com seguimento clínico superior a 4 anos, foi identificada uma assinatura com 113 transcritos, dos quais cerca de 30% são ncRNAs intrônicos, capaz de distinguir com 100% de acurácia pacientes que desenvolveram metástase daqueles que permaneceram livres da doença. Além de contribuir com novos candidatos a marcadores de prognóstico no câncer de mama, este estudo aponta para a participação de ncRNAs intrônicos em complexas redes transcricionais, possivelmente modulando a expressão de genes codificadores para proteínas. A caracterização detalhada da função de ncRNAs com expressão correlacionada a características fenotípicas e clínicas dos tumores de mama deverá fornecer novas informações sobre as bases moleculares da tumorigênese e progressão desta neoplasia. / Breast carcinoma is the most frequently occurring cancer amongst women in Brazil. The treatments available for breast cancer are prescribed based on the results of prognostic factors, such as the TNM classification system, histological type, hormonal receptor status and tumoral markers for cell proliferation. Nevertheless, breast cancer classification can be variable and inconsistent, and the prognosis power of tumoral markers is still limited, resulting in many patients unnecessarily undergoing adjuvant therapy. Therefore, there is an urge for new prognosis methods that are more sensitive, as well as accurate, in order to improve treatment decisions for breast cancer patients. From a basic science perspective, transcriptional modifications associated with oncogenesis and breast cancer progression are still poorly understood. Beyond alterations of the expression of protein-coding genes, recent evidences suggest that non-coding RNAs (ncRNAs) might have an important role in malignant transformation. The main goals of this project are: i) to investigate the expression of intronic ncRNAs in breast cancer tissue and ii) to identify gene expression signatures correlated to anatomo-pathological and clinical characteristics of human breast tumors, with a potential clinical aplication. To achieve this, gene expression profiles of 58 breast tumor samples with clinical follow-up were compared using a microarray platform enriched in non-coding RNAs (ncRNAs) derived from intronic regions of known human genes. During this project different gene expression methodologies were tested for the analysis of one- or two-color cDNA microarrays. The experimental design included the co-hybridization of the microarrays with fluorescent targets representing the tumor sample transcriptome with a reference oligonucleotide that is complementary to a 12 common region present in all cDNA probes (RefOligo). This experimental design permited the evaluation of two gene expression analysis approaches: the first based on direct intensities of each transcript (One-Color) and the second based in expression ratios where the intensity of each transcript is normalized by the reference oligonucleotide (RefOligo). One-Color methodology has shown to provide a more reproducible and sensitive gene expression signatures correlated to the breast samples characteristics and, therefore, this approach was chosen for subsequent analysis. The data provided by the microarray experiments revealed that ubiquitous expression of intronic ncRNAs was observed, confirming the relevance of investigating the role of this class of ncRNAs in breast cancer. Furthermore, a gene expression signature comprising 95 transcripts and correlated to the estrogen receptor status of breast tumor samples was identified, from which approximately 15% are ncRNAs. Using only samples from patients with known follow-up, a signature of 113 transcripts was identified, of which 30% are ncRNAs. This gene expression signature was able to distinguish with 100% accuracy patients that developed metastasis from those that remained disease-free up to 4 years after surgery. Besides the contribution of new molecular prognostic markers for breast cancer, the present study indicates that intronic ncRNAs might play a role in complex transcriptional networks, possibly regulating the expression of protein-coding genes. The detailed caracterization of the functional roles of ncRNAs, whose expression levels are correlated to fenotypical and clinical characteristics of breast tumors, is likely to provide new insigths on the molecular basis of tumorigenesis and progression of this neoplasia.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tiagohenrique_dissert.pdf: 1575194 bytes, checksum: 8271470b67a47a98cbae39ef169a4725 (MD5) Previous issue date: 2010-07-05 / Lung cancer is the most common malignancy in human. The average 5 years survival rate is one of the lowest among aggressive cancers, showing no significant improvement in recent years. When detected early, lung cancer has a good prognosis, but most patients present metastatic disease at the time of diagnostic, which significantly reduces survival rates. Despite all the recent advances in cancer treatment, prognostic of these patients have improved minimally. Objectives: The present study aimed to investigate the molecular profile of non-small cell lung cancer as well as new tumor makers relevant to diagnosis and prognosis of this disease. Methods: Total RNA from frozen surgical tissues was extracted using TRIZOL reagent and RNeasy FFPE kit was used for RNA extraction from formalin fixed, paraffin embedded tissue. Aiming to identify differentially expressed genes involved in lung cancer, we analyzed combined data from normal and tumor SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) libraries available in the public domain. Proteome profiling was also analyzed in adenocarcinoma, squamous cell carcinoma and normal surgical margin samples using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. Results: The statistical analysis of SAGE data indentified a subset of differentially expressed tags between normal surgical margins and adenocarcinoma libraries. Three genes displaying differential regulation in SAGE or proteomic analysis, two up- (COL3A1, CTSB) and one down-regulated (ITGB1) in neoplastic cells, were selected for real-time polymerase chain reaction (PCR) experiments using the same set of samples. Similar to the statistical results, quantitative PCR confirmed the upregulation of COL3A1 and CTSB in carcinomas when compared to tumor free tissues. Conclusion: RNA from frozen and arquived samples is appropriate for amplification experiments by real time PCR, although with lower efficiency among the last ones. Therefore, improved methods of RNA extraction in arquived tissues are suitable for Real Time quantitative RT-PCR, and may be used for gene expression profiling of paraffin embedded tissues from cancer patients. To the best of our knowledge, this is the first study reporting SAGE data analysis in lung cancer. The statistical approach as well as the proteomic evaluation were effective in identifying differentially expressed genes and proteins reportedly involved in cancer development and may be useful to disclose new tumor makers relevant to lung tumorigenesis. / O câncer de pulmão é a neoplasia humana mais comum. As taxas de sobrevida em 5 anos estão entre as mais baixas para tumores agressivos e seus valores não têm mostrado diferenças importantes nos últimos anos. Quando detectado nos estágios precoces, o câncer de pulmão mostra bom prognóstico, mas a maioria dos pacientes apresenta doença metastática no momento do diagnóstico, o que reduz a sobrevida significativamente. Apesar de todo o progresso obtido nos últimos anos em tratamento do câncer, o prognóstico desses pacientes permanece desfavorável. Objetivos: O presente estudo teve como objetivo investigar o perfil molecular de câncer de pulmão de células não pequenas, bem como de novos marcadores tumorais relevantes para diagnóstico e prognóstico dessa doença. Métodos: O RNA total de espécimes cirúrgicos congelados foi extraído pelo método do trizol e o kit RNeasy FFPE foi utilizado para extração de RNA de tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina. Com o objetivo de identificar genes diferencialmente expressos envolvidos em câncer de pulmão, dados combinados de bibliotecas SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) públicas foram analisados. O perfil protéico foi também avaliado em amostras de adenocarcinoma, carcinoma epidermóide e de margens cirúrgicas normais, utilizando eletroforese bidimensional e espectrometria de massas. Resultados: A análise estatística dos dados de SAGE identificou um conjunto de tags diferencialmente expressas entre as bibliotecas de adenocarcinoma e de margens cirúrgicas. Três genes com expressão alterada na análise de SAGE e de proteômica, dois com níveis elevados (COL3A1, CTSB) e um com nível reduzido (ITGB1) em células neoplásicas, foram selecionados para experimentos de PCR (reação em cadeia da polimerase) em tempo real no mesmo conjunto de amostras. Consistente com os resultados estatísticos, a PCR quantitativa confirmou a expressão elevada de COL3A1 e CTSB em carcinomas quando comparados com o tecido livre de tumor. Conclusão: O RNA de amostras congeladas e arquivadas é adequado para amplificação por PCR em tempo real, embora exiba qualidade mais baixa nessas últimas. Portanto, métodos otimizados para tecidos arquivados permitem análises por PCR quantitativa e podem ser utilizados para avaliação do perfil transcricional de espécimes embebidos em parafina procedentes de pacientes com câncer. Este é aparentemente o primeiro estudo descrevendo a análise de dados de SAGE em câncer de pulmão. As abordagens estatística e proteômica foram efetivas em identificar genes e proteínas diferencialmente expressas envolvidas no desenvolvimento do câncer e podem revelar novos marcadores relevantes para a tumorigênese de pulmão.

O carcinoma de célula renal (RCC) subtipo célula clara é o câncer mais letal e prevalente do sistema urinário. O diagnóstico deste tipo de câncer frequentemente é tardio em conseqüência da falta de sintomas perceptíveis aos pacientes. Um dos objetivos deste trabalho é a identificação de novos marcadores moleculares para diagnóstico precoce, o que ajudaria a diminuir a mortalidade em função de complicações resultantes do avanço da doença. Outro objetivo é a identificação de um conjunto de marcadores moleculares de prognóstico, de modo à prever com acurácia a evolução clínica da doença e, por conseqüência, o tempo de sobrevida do paciente. As modificações transcricionais associadas à carcinogênese e à progressão do câncer de rim ainda não foram completamente elucidadas. Além dos oncogenes e genes supressores de tumor, RNAs não-codificadores (ncRNAs) recentemente foram apontados como importantes reguladores da expressão gênica em humanos, e podem ter um papel importante na transformação maligna do câncer de rim. Para analisar a expressão gênica de ncRNAs e de genes codificadores para proteína foram utilizados dois microarranjos desenvolvidos por nosso grupo, enriquecidos em sondas para ncRNAs. Uma das plataformas possui 4 mil sondas de cDNA, das quais 822 sondas são para ncRNAs mapeando em regiões intrônicas. Outra possui 44 mil elementos e combina sondas de oligonucleotídeos (60-mer) intrônicas e exônicas de um mesmo locus genômico. Análises estatísticas foram feitas com a ferramenta Significance Analysis of Microarrays (q &#8804; 0,05) combinadas ou com a técnica de \"patient leave-one-out\" (genes com presença em 8 100% dos subconjuntos), ou alternativamente com o teste discriminante de Golub (p &#8804; 0,01 ou p < 0,05). Com a plataforma de 4 mil sondas foram estudadas 30 amostras de tecido renal de 18 pacientes com RCC subtipo célula clara. Um conjunto de 36 ncRNAs foi identificado como diferencialmente expresso entre amostras tumorais e não-tumorais. Uma assinatura adicional de 265 genes codificadores de proteínas foi identificada, indicando possíveis novos marcadores moleculares. Uma análise estatística supervisionada com dados de 16 pacientes identificou uma assinatura de ncRNAs correlacionada com sobrevida de 5 anos, formada por 27 ncRNAs com significativa expressão alterada em pacientes livres da doença em comparação com pacientes que morreram em função da doença. Uma assinatura adicional de 64 genes codificadores de proteínas também foi identificada como significativamente correlacionada com o acompanhamento clínico dos pacientes. Com a plataforma de 44 mil sondas foram analisados 17 pacientes, com amostras pareadas de tecido renal tumoral e não-tumoral agrupadas em 8 pools, sendo 4 de amostras tumorais e 4 de não-tumorais. Um conjunto de 66 ncRNAs parcialmente intrônicos antisenso e outro de 52 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso foram identificados como diferencialmente expressos. Identificamos um subconjunto de 28 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso e senso cuja expressão do gene codificador de proteína do mesmo locus estava simultaneamente alterada. Estes dados apontam para possíveis redes de regulação da expressão gênica dos ncRNAs em câncer. A extensa lista de ncRNAs e de genes codificadores para proteína identificados neste estudo podem ser promissores marcadores moleculares de carcinoma renal subtipo célula clara. / Renal cell carcinoma (RCC) is the most common malignancy of the adult kidney, and the clear cell subtype is the most prevalent and lethal cancer of the urinary system. Late diagnosis for this type of cancer is frequent, usually as a consequence of the lack of symptoms. One of the objectives of the present work is the identification of new molecular markers for the early diagnosis, which would help decrease mortality that develops as a function of disease progression. Another objective is the identification of a set of prognosis molecular markers, so as to accurately predict the clinical outcome of the disease, and consequently, patient survival. Transcriptional changes associated to carcinogenesis and to kidney cancer progression have not been entirely elucidated. Besides oncogenes and tumor suppressor genes, non-coding RNAs (ncRNAs) have been recently indicated as important regulators of gene expression in humans, and could have an important role in the malignant transformation in renal cancer. In order to measure ncRNA and protein-coding gene expression we have used two microarray platforms developed by our group, which are enriched in ncRNA probes. One of the platforms has 4 thousand cDNA probes, of which 822 are for ncRNAs that map to intronic regions. Another has 44 thousand elements and combines 60-mer oligonucleotide probes for intronic and exonic regions from the same genomic locus. Statistical analyses have been performed with the Significance Analysis of Microarrays tool (q &#8804; 0.05) combined with a patient leave-one-out approach (genes present in 100% of the sub-sets), or alternatively with Golubs discriminant test (p &#8804; 0.01 or p < 0.05). 11 With the 4-thousand probes platform we studied 30 samples from renal tissue of 18 RCC patients with clear cell subtype. A set of 36 ncRNAs has been identified as differentially expressed between tumor and non-tumor tissue. An additional signature of 265 protein-coding genes has been identified, indicating possible new molecular markers. A supervised statistical analysis with data from 16 patients has identified a ncRNA signature correlated to 5-year survival outcome, comprised of 27 ncRNAs with significantly altered expression in diseasefree patients compared to patients who died from cancer within the 5-year follow-up. An additional 64-gene signature of protein-coding genes has been identified as significantly correlated to clinical outcome. With the 44-thousand probes platform we have analyzed 17 patients, with paired tumor and non-tumor samples grouped into 8 pools, of which 4 were from tumor and 4 from nontumor samples. A set of 66 partially intronic antisense ncRNAs and another of 52 totally intronic antisense ncRNAs have been identified as differentially expressed between tumor and non-tumor tissue. A sub-set of 28 totally intronic antisense or sense ncRNAs were identified as having a simultaneous change in expression of the protein-coding gene from the same locus. Overall, the data point to a possible ncRNA regulatory network in cancer. The extensive lists of ncRNAs and of protein-coding genes identified in the present study can be seen as promising molecular markers of RCC from the clear-cell subtype.