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Cariotipo y aspectos citogenéticos de Dactylopius coccus Costa, 1835: "la cochinilla del carmín"Molero Obregón, Sally Jesmille January 2009 (has links)
Dactylopius coccus Costa, Dactylopiidae: Hemíptera, es un insecto parásito de las cactáceas y es muy apreciado por su contenido de ácido carmínico producto que es aprovechado por el hombre desde hace muchos siglos. Con el desarrollo de la biotecnología, la demanda del ácido carmínico se ha incrementado, por lo que se han venido desarrollando diferentes metodologías con el fin de mejorar la producción del mismo.
La Citogenética es una herramienta básica para la mejora de especies, además de su utilidad en otras áreas como la sistemática evolutiva, e ingeniería genética, este tipo de investigaciones en la cochinilla del carmín son de mucha importancia para el Perú, porque es el primer productor de carmín a nivel mundial.
En el presente trabajo se determinó el cariotipo de Dactylopius coccus Costa, obteniéndose que su número diploide es 2n=16 cromosomas, todos son holocéntricos y disminuyen gradualmente en tamaño desde el primer par homólogo hasta el último. Así mismo se caracterizó la mitosis, que es particular por la naturaleza holocéntrica de los cromosomas y al estudiarse en células embrionarias se observó la heterocromatinización como mecanismo de determinación del sexo, donde la condensación de los cromosomas es homogénea en hembras y heterogénea en machos. Los procesos de poliploidía observados parecen estar relacionados con el desarrollo del embrión. Finalmente se observó la presencia eventual de micronúcleos, lo que resulta indicador de contaminación ambiental en la zona de colecta. / --- Dactylopius coccus Costa, Dactylopiidae: Hemiptera, is a parasitic insect of the cactaceous ones and is very appreciated by its carminic acid content product that is profiteer by the man for many centuries. With the development of the biotechnology, the demand of carminic acid has been increased, reason why they have come developing different methodologies with the purpose of to improve the production of the same.
Cytogenetic is a basic tool for the improvement of species, besides its utility in other areas like evolutionary systematic, and genetic engineering, this type of investigations in the cochineal of the carmine one are of much importance for Peru because it is the first producer of carmine at world-wide level.
In the present work karyotype of Dactylopius coccus Costa was determined, obtaining itself that its diploide number is 2n=16 chromosomes, all is holocentric and falls gradually in size from the first homologous pair to the last one. Also the mitosis was characterized, that is particular by the holocentric nature of the chromosomes and when studying in embryonic cells the heterochromatinization like mechanism of determination of sex was observed, where the condensation of the chromosomes is homogenous in females and heterogeneous in males. The observed processes of poliploidy seem to be related to the development of the embryo. Finally the possible presence of micronuclei was observed, which is indicating from environmental contamination in the zone of collection. / Tesis
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Cariotipo y aspectos citogenéticos de Dactylopius coccus Costa, 1835: "la cochinilla del carmín"Molero Obregón, Sally Jesmille January 2009 (has links)
Dactylopius coccus Costa, Dactylopiidae: Hemíptera, es un insecto parásito de las cactáceas y es muy apreciado por su contenido de ácido carmínico producto que es aprovechado por el hombre desde hace muchos siglos. Con el desarrollo de la biotecnología, la demanda del ácido carmínico se ha incrementado, por lo que se han venido desarrollando diferentes metodologías con el fin de mejorar la producción del mismo. La Citogenética es una herramienta básica para la mejora de especies, además de su utilidad en otras áreas como la sistemática evolutiva, e ingeniería genética, este tipo de investigaciones en la cochinilla del carmín son de mucha importancia para el Perú, porque es el primer productor de carmín a nivel mundial. En el presente trabajo se determinó el cariotipo de Dactylopius coccus Costa, obteniéndose que su número diploide es 2n=16 cromosomas, todos son holocéntricos y disminuyen gradualmente en tamaño desde el primer par homólogo hasta el último. Así mismo se caracterizó la mitosis, que es particular por la naturaleza holocéntrica de los cromosomas y al estudiarse en células embrionarias se observó la heterocromatinización como mecanismo de determinación del sexo, donde la condensación de los cromosomas es homogénea en hembras y heterogénea en machos. Los procesos de poliploidía observados parecen estar relacionados con el desarrollo del embrión. Finalmente se observó la presencia eventual de micronúcleos, lo que resulta indicador de contaminación ambiental en la zona de colecta. / Dactylopius coccus Costa, Dactylopiidae: Hemiptera, is a parasitic insect of the cactaceous ones and is very appreciated by its carminic acid content product that is profiteer by the man for many centuries. With the development of the biotechnology, the demand of carminic acid has been increased, reason why they have come developing different methodologies with the purpose of to improve the production of the same. Cytogenetic is a basic tool for the improvement of species, besides its utility in other areas like evolutionary systematic, and genetic engineering, this type of investigations in the cochineal of the carmine one are of much importance for Peru because it is the first producer of carmine at world-wide level. In the present work karyotype of Dactylopius coccus Costa was determined, obtaining itself that its diploide number is 2n=16 chromosomes, all is holocentric and falls gradually in size from the first homologous pair to the last one. Also the mitosis was characterized, that is particular by the holocentric nature of the chromosomes and when studying in embryonic cells the heterochromatinization like mechanism of determination of sex was observed, where the condensation of the chromosomes is homogenous in females and heterogeneous in males. The observed processes of poliploidy seem to be related to the development of the embryo. Finally the possible presence of micronuclei was observed, which is indicating from environmental contamination in the zone of collection.
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Redes de Interacción Formadas por Coleópteros y Dípteros (Syrphidae) Saproxílicos en Oquedades Arbóreas del Bosque Mediterráneo IbéricoSánchez Galván, Ingrid R. 27 September 2017 (has links)
En la presente tesis doctoral se presenta un estudio profundo de los ensambles formados por insectos saproxílicos (Coleópteros y Dípteros Syrphidae) ligados a las cavidades arbóreas de quercínas ibéricas (Quercus spp). Las especies saproxílicas (coleópteros y dípteros sírfidos) conforman complejas redes ecológicas conectadas a través de diferentes interacciones de especies insecto-insecto. Nuestros hallazgos recalcan la importancia para la conservación de la comunidad entomológica saproxílica, centrar la atención en el estudio de especies clave que cumplen un papel fundamental en la organización de los ensambles al condicionar la presencia o la ausencia de otras especies o gremios de especies que se desarrollan dentro de cada oquedad (ej. especies “ingenieros del ecosistema”). Ponemos de manifiesto también la importancia que tiene la microbiota dentro la oquedad como recurso trófico de las fases larvarias acuáticas de especies de sírfidos que como adultos, son visitantes florales asiduos de las flores de nuestros bosques mediterráneos.
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Biología de los sírfidos (Diptera: Syrphidae) de los ecosistemas insulares de la Comunidad Valenciana: aspectos de la relación sírfido-plantaPérez-Bañón, Celeste 10 April 2000 (has links)
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Diversidad y patogenicidad de especies de hongos entomopatógenos en insectos plaga de la yerba mate Ilex paraguariensis en la provincia de MisionesSchapovaloff, María Elena 06 March 2013 (has links)
Las especies de hongos entomopatógenos nativos presentan en general mayor especificidad para los hospedadores de los cuales fueron aislados originalmente y además se adaptan mejor a las condiciones ambientales del lugar de origen, que los hongos patógenos procedentes de hospedantes y lugares diferentes.
El objetivo general de esta tesis es estudiar la diversidad y patogenicidad de hongos patógenos de insectos plaga de la yerba mate en la región del Noreste Argentino.
Los objetivos específicos son:
1) Relevar, aislar e identificar los hongos entomopatógenos de insectos plaga en cultivos de yerba mate y suelos de importancia en la región del NEA (Misiones).
2) Estimar la patogenicidad de los hongos entomopatógenos aislados e identificados en condiciones controladas de laboratorio.
3) Preservar los cultivos fúngicos obtenidos en una colección de cultivos de referencia.
4) Caracterizar los hongos entomopatógenos mediante técnicas de biología molecular
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Resistência em genótipos de Brachiaria a ninfas de três espécies de cigarrinha-das-pastagens (Hemiptera: Cercopidae) / Resistencia en genotipos de Brachiaria a ninfas de tres especies de salivazo de los pastos (Hemiptera: Cercopidae)Valverde, Alejandro Hipólito Pabón 28 March 2006 (has links)
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Previous issue date: 2006-03-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Varias espécies de cigarrinha-das-pastagens (Hemiptera: Cercopidae) são pragas de importância nas pastagens do Brasil. Elas têm o potencial de ocasionar grandes perdas em milhões de hectares de pastagens melhoradas de Braquiária. Em culturas de baixo valor econômico como as pastagens, é necessário desenvolver métodos de controle de baixo custo, como a resistência de plantas a insetos. A introdução de germoplasma de Brachiaria pelo CIAT, tem estimulado a avaliação de genótipos com resistência a esta praga. Neste trabalho, conduzido no CTZM da EPAMIG, Viçosa-MG, avaliou-se o comportamento de 17 genótipos de Brachiaria ao ataque de ninfas de três das principais espécies de cigarrinha presentes no Brasil: Notozulia entreriana (Berg), Deois schach (Fabricius) y Deois flavopicta (Stal). Os experimentos conduziram-se em casa de vegetação (23.2o C; 71% RH). A resposta dos genótipos estúdio-se mediante a técnica de avaliação de resistência de Brachiaria às cigarrinhas, desenvolvida pelo programa de melhoramento genético do CIAT. Dois genótipos de resposta contrastante ao ataque das cigarrinhas usaram-se para comparar os níveis de resistência: BRA001058 (testemunha suscetível) e BRA000591 (testemunha resistente). De maneira complementaria, realizaram-se estúdios para caracterizar a antibiose e a tolerância como mecanismos de resistência no aceso de B. brizantha BRA004308, recentemente lançado como cv. Xaraés. Encontraram-se diferentes níveis de dano e sobrevivencia de ninfas nos genótipos de Brachiaria, sugerindo a expressão de antibiosis e/ou de tolerância como mecanismos de resistência às ninfas das cigarrinhas. O aceso BRA004308 mostrou alta antibioses a D. schach, antibioses moderada a D. flavopicta e tolerância a N. entreriana. Encontrou-se que os mecanismos e níveis de resistência em genótipos de Brachiaria podem de variar dependendo da espécie de cigarrinha. Para identificar genótipos superiores com resistência múltipla, é necessário conduzir ciclos de seleção baseadas na reação simultânea a varias espécies de cigarrinha. / Varias especies del salivazo de los pastos (Hemiptera: Cercopidae) son plagas de importancia económica en pasturas en el Brasil. Tienen el potencial de causar grandes pérdidas en millones de hectáreas de pasturas mejoradas de Braquiária. En cultivos de bajo valor económico como las pasturas, es necesario desarrollar medidas de control de bajo costo, como la resistencia de plantas a insectos. La introducción de germoplasma de Brachiaria por el CIAT, ha estimulado la búsqueda de genotipos resistentes a esta plaga. En este trabajo, conducido en el CTZM de EPAMIG, Viçosa-MG, se evaluó el comportamiento de 17 genotipos de Brachiaria frente a tres de las especies de salivazo de mayor importancia en el Brasil: Notozulia entreriana (Berg), Deois schach (Fabricius) y Deois flavopicta (Stal). Los experimentos se conducieron en invernadero (23.2o C; 71% RH). La respuesta de los genotipos se estudió mediante la técnica de evaluación de resistencia de Brachiaria al salivazo desarrollada en el programa de mejoramiento genético del CIAT. Dos genotipos de respuesta contrastante al ataque del salivazo, fueron usados para comparar los niveles de resistencia: BRA001058 (testigo susceptible) y BRA000591 (testigo resistente). Se realizaron además estudios para caracterizar la antibiosis y tolerancia como mecanismo de resistencia en la accesión BRA004308, recientemente liberada como cv. Xaraés. Diferentes niveles de daño y sobrevivencia de ninfas se encontraron en los genotipos de Brachiaria, sugiriendo la expresión de antibiosis y/o de tolerancia como mecanismos de resistencia a las ninfas de salivazo. La accesión BRA004308 mostró alta antibiosis a D. schach, antibiosis moderada a D. flavopicta y tolerancia a N. entreriana. Se encontró que los mecanismos y niveles de resistencia en genotipos de Brachiaria pueden variar dependiendo de la especie de salivazo evaluada. Para identificar genotipos superiores con resistencia antibiótica múltiple, es necesario conducir ciclos de selección basados en la reacción simultánea a varias especies de salivazo.
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Physiological and biochemical insights into pepper (Capsicum annuum L.) responses to green peach aphid (Myzus persicae Sulzer)Florencio-Ortiz, Victoria 05 April 2019 (has links)
Introducción general. Los pulgones representan una de las plagas más importantes económicamente en la agricultura mundial. Su impacto negativo se relaciona, en parte, con su capacidad de reproducirse por partenogénesis junto con un tiempo de generación corto, lo que les permite alcanzar altas densidades de población. El pulgón Myzus persicae es la plaga de pulgón más importante del mundo a nivel económico. Destaca especialmente por ser altamente polífago ya que se alimenta de más de 400 especies de plantas de 50 familias diferentes, afectando a importantes cultivos agrícolas y hortícolas. Además, M. persicae es vector de más de 100 enfermedades virales y es la especie de pulgón que ha desarrollado más mecanismos (al menos seis tipos) de resistencia a insecticidas. Por lo tanto, resulta de vital importancia la identificación de factores moleculares y mecanismos que contribuyan a las defensas de la planta y limiten la infestación del pulgón. El crecimiento de la población mundial y de la consiguiente demanda de alimentos requiere un mayor rendimiento de los cultivos, así como una mayor resistencia de estos a los estreses ambientales. Además, existe una tendencia social creciente a mejorar la producción de los cultivos a través de medios seguros y sostenibles que reduzcan el uso de pesticidas. En este sentido, comprender la naturaleza química de las complejas interacciones planta-pulgón resulta indispensable para optimizar la producción de nuevos cultivos. Los estudios realizados hasta el momento muestran que tanto la señalización como las respuestas de defensa son altamente específicas de interacciones planta-pulgón concretas. Esto destaca la importancia de estudiar sistemas específicos en lugar de basarse en los mecanismos descritos en plantas modelo. Desarrollo técnico. El objetivo principal de esta Tesis Doctoral es obtener una visión integrada de la dinámica espacial y temporal de la interacción planta-pulgón en una especie no modelo, pero de gran relevancia en la agricultura Mediterránea, como es el pimiento (Capsicum annuum L.). Para ello, se han caracterizado las respuestas químicas de las hojas del pimiento a la infestación por el pulgón verde del melocotonero Myzus persicae (Sulzer, 1776), utilizando la técnica de cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas. Los metabolitos analizados en esta tesis incluyen aminoácidos (como metabolitos primarios con función dual en las interacciones planta-pulgón), fitohormonas (implicadas en la señalización de la defensa de la planta), proteínas (proporcionan un análisis a gran escala del metabolismo a través de un enfoque proteómico) y ácidos fenólicos (como metabolitos secundarios con funciones en defensa). Además, se han realizado diferentes experimentos que incluyen un seguimiento detallado del curso temporal de la infestación (desde las 3 horas hasta los 7 días post-infestación) y también se ha realizado el análisis a nivel local y sistémico utilizando para ello trampas de tipo clip (clip cages). Conclusiones. 1. Diferentes análisis fitoquímicos, incluyendo hormonas involucradas en las rutas de señalización que controlan el crecimiento y las respuestas de defensa de las plantas, el estudio proteómico a gran escala, y el análisis de metabolitos primarios (aminoácidos) y secundarios (ácidos fenólicos), han demostrado que el pulgón verde del melocotonero Myzus persicae (Sulzer, 1776) a una baja densidad de infestación permanece sin ser detectado o no desencadena una respuesta de gran magnitud en las plantas de pimiento (Capsicum annuum L.). 2. M. persicae induce cambios significativos en la composición de aminoácidos libres de las hojas de pimiento, dependiendo tanto de la densidad de infestación como del tiempo post-infestación. 3. Mientras que a alta densidad M. persicae produce un gran incremento en el contenido total de aminoácidos libres, a baja densidad el contenido de aminoácidos libres disminuye considerablemente a los 7 días post-infestación. 4. El aumento en el contenido total de aminoácidos libres se debe principalmente a un incremento en los aminoácidos esenciales. En términos cuantitativos, los aminoácidos con mayor incremento en su contenido son los aromáticos fenilalanina y tirosina, los aminoácidos de cadena ramificada, valina, leucina e isoleucina, y un grupo formado por alanina, arginina, lisina, metionina y treonina. 5. El análisis de fitohormonas ha demostrado que la mayor parte de las respuestas ocurren a nivel local. 6. Las vías de señalización del ácido jasmónico y el ácido salicílico están ambas involucradas en las respuestas moleculares del pimiento a M. persicae. 7. La ruta de señalización del ácido jasmónico responde más rápidamente y con una mayor magnitud que la del ácido salicílico, la cual se induce sólo en las últimas etapas de la infestación. 8. Los niveles endógenos del ácido indolacético no se alteran significativamente en las plantas de pimiento en respuesta al pulgón, incluso bajo una elevada densidad de infestación. 9. Las plantas de pimiento infestadas con una alta densidad de pulgón muestran una reducción en la longitud del tallo, el número de hojas y el ancho de la hoja a los 7 días post-infestación. 10. El análisis proteómico ha revelado un patrón general en las respuestas de las proteínas de las hojas de pimiento al ataque del pulgón, según el cual la expresión de la mayor parte de las proteínas aumenta a tiempos cortos pero disminuye con el progreso de la infestación. 11. El pobre solapamiento observado entre las proteínas con expresión diferencial a diferentes tiempos de infestación indica que la mayoría de las proteínas se regulan solo de forma transitoria. 12. Un elevado número (46,8%) de las proteínas con expresión diferencial son cloroplásticas, lo que subraya la relevancia de este orgánulo en la respuesta de la planta a los pulgones. 13. La mayoría de los cambios se producen en proteínas que son necesarias para el funcionamiento de la planta en condiciones normales, incluyendo proteínas involucradas en fotosíntesis y fotorrespiración, metabolismo de aminoácidos y carbohidratos, traducción, y plegamiento y degradación de proteínas. Sin embargo, el número de proteínas directamente involucradas en la defensa de la planta es bajo y su expresión está mayoritariamente reprimida en respuesta al ataque del pulgón. 14. El análisis de los ácidos fenólicos libres ha revelado que una alta densidad de infestación por pulgón induce la alteración en el contenido de todos los ácidos fenólicos libres analizados en algún momento de la infestación, con excepción del ácido clorogénico. 15. Los ácidos gálico, p-hidroxibenzoico, cafeico, p-cumárico y sinápico aumentan su contenido en las hojas de pimiento a tiempos cortos de infestación (1 día) pero disminuyen por debajo del control (excepto el ácido sinápico) a tiempos más largos. 16. Los ácidos protocatéquico y salicílico muestran un patrón de variación opuesto en las hojas de pimiento en respuesta al pulgón.
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USING RECOMBINANT HUMAN CARBAMOYL PHOSPHATE SYNTHETASE 1 (CPS1) FOR STUDYING THIS ENZYME'S FUNCTION, REGULATION, PATHOLOGY AND STRUCTUREDíez Fernández, Carmen 09 July 2015 (has links)
[EN] Carbamoyl phosphate synthetase 1 (CPS1), a 1462-residue mitochondrial enzyme, catalyzes the entry of ammonia into the urea cycle, which converts ammonia, the neurotoxic waste product of protein catabolism, into barely toxic urea. The urea cycle inborn error and rare disease CPS1 deficiency (CPS1D) is inherited with mendelian autosomal recessive inheritance, being due to CPS1 gene mutations (>200 mutations reported), and causing life-threatening hyperammonemia.
We have produced recombinantly human CPS1 (hCPS1) in a baculovirus/insect cell expression system, isolating the enzyme in active and highly purified form, in massive amounts. This has allowed enzyme crystallization for structural studies by X-ray diffraction (an off-shoot of the present studies). This hCPS1 production system allows site-directed mutagenesis and enzyme characterization as catalyst (activity, kinetics) and as protein (stability, aggregation state, domain composition). We have revealed previously unexplored traits of hCPS1 such as its domain composition, the ability of glycerol to replace the natural and essential CPS1 activator N-acetyl-L-glutamate (NAG), and the hCPS1 protection (chemical chaperoning) by NAG and by its pharmacological analog N-carbamyl-L-glutamate (NCG).
We have exploited this system to explore the effects on the activity, kinetic parameters and stability/folding of the enzyme, and to test the disease-causing nature, of mutations identified in patients with CPS1 deficiency (CPS1D). These results, supplemented with those obtained with other non-clinical mutations, have provided novel information on the functions of three non-catalytic domains of CPS1.
We have introduced three CPS1D-associated mutations and one trivial polymorphism in the glutaminase-like domain of CPS1, supporting a stabilizing and an activity-enhancing function of this non-catalytic domain. Two mutations introduced into the bicarbonate phosphorylation domain have shed light on bicarbonate binding and have directly confirmed the importance of this domain for NAG binding to the distant (in the sequence) C-terminal CPS1 domain. The introduction of 18 CPS1D-associated missense mutations mapping in a clinically highly eloquent central non-catalytic domain have proven the disease-causing nature of most of these mutations while showing that in most of the cases they trigger enzyme misfolding and/or destabilization. These results, by proving an important role of this domain in the structural integration of the multidomain CPS1 protein, have led us to call this domain the Integrating Domain.
Finally, we have examined the effects of eight CPS1D-associated mutations, of one trivial polymorphism and of five non-clinical mutations, all of them mapping in the C-terminal domain of the enzyme where NAG binds, whereas we have re-analyzed prior results with another four clinical and five non-clinical mutations affecting this domain. We have largely confirmed the pathogenic nature of the clinical mutations, predominantly because of decreased activity, in many cases due to hampered NAG binding. A few mutations had substantial negative effects on CPS1 stability/folding. Our analysis reveals that NAG activation begins with a movement of the final part of the ß4-¿4 loop of the NAG site. Transmission of the activating signal to the phosphorylation domains involves helix ¿4 from this domain and is possibly transmitted by the mutually homologous loops 1313-1332 and 778-787 (figures are residue numbers) belonging, respectively, to the carbamate and bicarbonate phosphorylation domains. These two homologous loops are called from here on Signal Transmission Loops. / [ES] La carbamil fosfato sintetasa 1 (CPS1), una enzima mitocondrial, cataliza la entrada del amonio en el ciclo de la urea, que convierte esta neurotoxina derivada del catabolismo de las proteínas en urea, mucho menos tóxica. El déficit de CPS1 (CPS1D) es un error innato del ciclo de la urea, una enfermedad rara autosómica recesiva, que se debe a mutaciones en el gen CPS1 (>200 mutaciones descritas) y que cursa con hiperamonemia.
Hemos producido CPS1 humana recombinante (hCPS1) en un sistema de expresión de células de insecto y baculovirus, y la hemos aislado en forma activa, muy pura y en cantidad elevada. Este sistema de producción de hCPS1 permite la realización de mutagénesis dirigida y la caracterización de la enzima como catalizador (actividad, cinética) y como proteína (estabilidad, estado de agregación y composición de dominios). Hemos revelado características de la hCPS1 antes no exploradas como es la composición de dominios, la capacidad que tiene el glicerol para reemplazar al activador natural y esencial de la CPS1, N-acetil-L-glutamato (NAG), y la protección de la hCPS1 por NAG y por su análogo farmacológico N-carbamil-L-glutamato (NCG) (chaperonas químicas).
Hemos utilizado este sistema para explorar los efectos en actividad, parámetros cinéticos y estabilidad/plegamiento de la enzima, y para comprobar la naturaleza patogénica de mutaciones identificadas en pacientes con CPS1D. Estos resultados, junto con los obtenidos con otras mutaciones no clínicas, han aportado información novedosa sobre tres de los dominios no catalíticos de CPS1.
Las observaciones realizadas tras introducir en el dominio de tipo glutaminasa de la enzima tres mutaciones asociadas a CPS1D y un polimorfismo trivial, apoyan la contribución de este dominio no catalítico a la estabilidad y a aumentar la actividad de la enzima. Dos mutaciones introducidas en el dominio de fosforilación de bicarbonato han arrojado luz sobre el modo de unión del bicarbonato (un sustrato). Los resultados de estas mutaciones también han confirmado la contribución de este dominio para la unión de NAG, cuyo sitio de unión se encuentra en el dominio C-terminal de CPS1, bastante alejado (en la secuencia) del dominio de fosforilación de bicarbonato. Además, hemos introducido 18 mutaciones de cambio de sentido asociadas a CPS1D, las cuales están localizadas en un dominio no catalítico, central y de elevada elocuencia clínica. Estos resultados han demostrado la naturaleza patogénica de estas mutaciones, ya que en la mayoría de los casos estas mutaciones producen un mal plegamiento o/y desestabilización de la enzima. Debido a que estos resultados han puesto de manifiesto el importante papel de este dominio en la integración estructural de la proteína multidominio CPS1, lo hemos llamado Dominio Integrador.
Finalmente, hemos examinado los efectos de 8 mutaciones asociadas a CPS1D, de un polimorfismo trivial y de 5 mutaciones no clínicas, todas localizadas en el dominio C-terminal de la enzima, donde se une NAG. Además, hemos reanalizado resultados anteriores con otras 4 mutaciones clínicas y 5 no clínicas afectando a este dominio. Hemos confirmado el carácter patogénico de las mutaciones clínicas, las cuales predominantemente causan una disminución en la actividad enzimática, en muchos casos debida a que la unión de NAG se encuentra obstaculizada. Unas pocas mutaciones mostraron efectos negativos en la estabilidad/plegamiento de CPS1. Nuestros análisis revelan que la activación por el NAG empieza con un movimiento de la parte final del bucle ß4-¿4 del sitio de NAG. La transmisión de la señal activadora a los dominios de fosforilación implica a la hélice ¿4 de este dominio y posiblemente se transmite a través de los bucles homólogos 1313-1332 y 778-787 (numeración de residuos) pertenecientes, respectivamente, a los dominios de fosforilación de carbamato y bicarbonato. Por ello, hemos llamado a ambos bucles Bucles de / [CAT] La carbamil fosfat sintetasa 1 (CPS1), un enzim mitocondrial, catalitza l'entrada d'amoni en el cicle de la urea, que convertix l'amoni, producte neurotòxic del catabolisme de les proteïnes, en urea, una molècula molt poc tòxica. El dèficit de CPS1 (CPS1D) és un error innat del cicle de la urea, una malaltia rara autosòmica recessiva, que es deu a mutacions en el gen CPS1 (>200 mutacions descrites) i que cursa amb hiperamonièmia.
Hem produït CPS1 humana recombinant (hCPS1) en un sistema d'expressió de cèl·lules d'insecte i baculovirus, i l'hem aïllada en forma activa, molt pura i en gran quantitat. Això ha permés la cristal·lització de l'enzim per a estudis estructurals amb difracció de raios-X (treball no inclòs en esta tesi Aquest sistema de producció de hCPS1 permet la realització de mutagènesi dirigida i la caracterització de l'enzim com a catalitzador (activitat, cinètica) i com a proteïna (estabilitat, estat d'agregació i composició de dominis). Hem revelat característiques de la hCPS1 no explorades abans com és la composició de dominis, la capacitat que té el glicerol per a reemplaçar l'activador natural i essencial de CPS1, N-acetil-L-glutamat (NAG), i la protecció de la hCPS1 per NAG i pel seu anàleg farmacològic N-carbamil-L-glutamat (NCG) (xaperones químiques) .
Hem utilitzat aquest sistema per a explorar els efectes en l'activitat, els paràmetres cinètics i l'estabilitat/plegament de l'enzim, i per a comprovar la naturalesa patogènica de mutacions identificades en pacients amb CPS1D. Aquestos resultats, junt amb els obtinguts amb altres mutacions no clíniques, han aportat informació nova sobre tres dels dominis no catalítics de la CPS1.
Les observacions, després d'introduir tres mutacions associades a CPS1D i un polimorfisme trivial en el domini tipus glutaminasa de CPS1, recolzen la contribució d'aquest domini no catalític a l'estabilitat i a l'optimització de l'activitat enzimàtica. Dues mutacions introduïdes en el domini de fosforilació de bicarbonat han esclarit el mode d'unió de bicarbonat. Els resultats d'aquestes mutacions també han confirmat la contribució d'aquest domini per a la unió de NAG, el lloc d'unió de la qual es troba en el domini C-terminal de CPS1, prou allunyat (en la seqüència) del domini de fosforilació de bicarbonat. A més, hem introduït 18 mutacions de canvi de sentit associades a CPS1D, les quals estan localitzades en un domini no catalític, central i d'elevada eloqüència clínica. Aquestos resultats han demostrat la naturalesa patogènica d'aquestes mutacions, ja que, en la majoria dels casos produïxen un mal plegament o/i desestabilització de l'enzim. Pel fet que aquestos resultats han posat de manifest l'important paper d'aquest domini en la integració estructural de la proteïna multidomini CPS1, l'hem anomenat Domini Integrador.
Finalment, hem examinat els efectes de huit mutacions associades a CPS1D, un polimorfisme trivial i cinc mutacions no clíniques, totes elles localitzades en el domini C-terminal de l'enzim, on s'unix NAG. A més, hem reanalitzat resultats anteriors amb altres quatre mutacions clíniques i cinc no clíniques que afecten aquest domini. Hem confirmat el caràcter patogènic de les mutacions clíniques, les quals predominantment causen una disminució en l'activitat enzimàtica, en molts casos pel fet que la unió de NAG es troba obstaculitzada. Unes poques mutacions van mostrar efectes negatius substancials en l'estabilitat/plegament de CPS1. Les nostres anàlisis revelen que l'activació de NAG comença amb un moviment de la part final del bucle ß4-¿4 del lloc de NAG. La transmissió del senyal activadora als dominis de fosforilació involucra l'hèlix ¿4 d'aquest domini i es transmet, possiblement, a través dels bucles homòlegs 1313-1332 i 778-787 (numeració dels residus), pertanyents, respectivament, als dominis de fosforilació de carbamato i bicarbonat. Per això, hem anomenat a ambd / Díez Fernández, C. (2015). USING RECOMBINANT HUMAN CARBAMOYL PHOSPHATE SYNTHETASE 1 (CPS1) FOR STUDYING THIS ENZYME'S FUNCTION, REGULATION, PATHOLOGY AND STRUCTURE [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/52855 / TESIS
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Optimización de procedimientos técnico-científicos aplicados a la restauración del Patrimonio CulturalSalmerón Escobar, Pedro 18 July 2013 (has links)
Esta tesis doctoral es el resultado de una dilatada experiencia de investigación en torno al
papel esencial protagonizado por la vertiente técnico¿científica en la restauración de bienes
inmuebles principalmente. Para ello, se ha perseguido presentarla, de forma ordenada y
sistemática, potenciando su aplicabilidad práctica por parte de los diferentes agentes que
intervienen en los procesos de intervención. Aunque esta metodología se centra, sobre todo,
en edificios con una amplia casuística desde el punto de vista de la conservación, es
exportable también a otros casos para utilizarse como herramienta en la elaboración y
desarrollo del proyecto y la intervención restauradora.
Se demuestra que es posible establecer una retroalimentación entre la obra y el trabajo
analítico para depurar un sistema de actuación que facilite la aplicación de los conocimientos y
clarifique el proceso restaurador. Esta investigación ha dado como resultado un núcleo
cohesionado de pautas que hace de ¿motor de arranque¿ para la aplicación de procedimientos
técnico ¿ científicos creando una amplia red de relaciones, de forma que las experiencias
desarrolladas se convierten en modelos de intervención al destacar lo más interesante de cada
una.
El método seguido se presenta en forma de protocolos, articulados de manera clara, para crear
un sistema jerarquizado y ramificado en el que las secuencias lógicas pueden ejecutarse de
forma independiente, en función de las prioridades o necesidades, facilitando su realización. Ha
sido planteado, de manera directa, utilizando un lenguaje técnico asequible para los diferentes
agentes que intervienen en los procesos. La herramienta conseguida es versátil y apta para
servir de guía de buenas prácticas en las intervenciones.
Uno de los ejes fundamentales de desarrollo es la conservación preventiva que establece la
necesidad de planificar las acciones estudiando los riesgos a los que está sometido el
patrimonio cultural, adoptar medidas para evitar posibles afecciones y procurar el
mantenimiento correcto de sus características materiales, estrategias que permiten una gestión
más adecuada de los recursos disponibles. Esa visión integradora incluye una comunicación
constante con los actores implicados garantizando la sostenibilidad del proceso.
La investigación aplicada se ha organizado a partir del caso concreto de la Catedral de Jaén,
que presenta unas condiciones excepcionales para verificar la relación entre diferentes procesos de deterioro y la aplicación de una metodología de restauración en circunstancias reales y
con una disponibilidad limitada de recursos. Aunque dicho inmueble actúa como fuente principal de la experiencia, existen abundantes ejemplos que provienen fundamentalmente de otros
edificios en los cuales se ha aplicado el mismo criterio secuencial para ordenar la información y
poderla utilizar de forma coherente y organizada. / Salmerón Escobar, P. (2013). Optimización de procedimientos técnico-científicos aplicados a la restauración del Patrimonio Cultural [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/31206 / TESIS
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