Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Several lines of evidence support the hypotheses that the oxidation of low density lipoprotein (LDL) is a proatherogenic factor. Oxidative stress is one of the causes of the overproduction of reactive species that increase the formation of oxidized LDL. Thiosemicarbazones are compounds used in anticancer, antiviral and antifungal therapy; however, their redox activities have been controversial. Thus, we tested, in vitro, the possible antioxidant activity of a thiosemicarbazone derivate, the isatin-3-N4-benzilthiosemicarbazone (IBTC). We measured the conjugated diene formation in serum and LDL induced by two oxidant agents, 2,2-azobis(2-amidinopropane dihydrochloride) (AAPH) and Cu2+, as well as the loss of tryptophan fluorescence in LDL induced by Cu2+. The total reactive antioxidant potential (TRAP), Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) formation in human LDL and plasma and in different rat tissues was also assessed. The toxicity of IBTC was measured using aortic slices viability assay. The results show that IBTC reduced the formation of conjugated dienes AAPH and Cu2+- induced increased in a dose-dependent manner the lag phase. IBTC also prevented the tryptophan fluorescence loss, and reduced the TBARS formation in LDL, plasma and rat tissues, showing no toxicity to aortic slices. These data indicate that IBTC is a good antioxidant and a promising antiatherogenic agent for further studies in vivo. / Muitos estudos têm revelado que a oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL) é um fator pró-aterogênico e que o estresse oxidativo tem um papel central na formação de LDL oxidada. As Tiossemicarbazonas são compostos usados em terapias anti-câncer, antiviral e antifúngica em humanos. No entanto, estudos sobre a atividade redox desta classe de moléculas ainda são bastante controversos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antioxidante de um composto derivado de uma tiossemicarbazona: a isatina-3-N4-benziltiossemicarbazona (IBTC) e seu possível efeito protetor contra a oxidação da LDL in vitro. Tais atividades foram avaliadas através da formação de dienos conjugados em LDL e em soro humano induzidos por 2,2-azobis(2-amidinopropano diidroclorido) AAPH e por CuSO4; da perda da fluorescência do triptofano (Trp) em LDL induzida pelo CuSO4; da formação de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em LDL, plasma humano e em diferentes tecidos de ratos e do potencial antioxidante total (TRAP) do IBTC. A toxicidade do IBTC foi investigada em fatias da artéria aorta. Os resultados mostraram que a IBTC foi eficaz em reduzir a formação de dienos conjugados induzidos tanto pelo AAPH quanto pelo CuSO4, aumentando de modo concentração-dependente a fase lag. A IBTC também preveniu a perda acentuada da fluorescência do Trp, reduziu a formação de TBARS na LDL no plasma e nos tecidos isolados de ratos e não causou toxicidade em fatias da artéria aorta. Esses dados indicam que a IBTC pode ser considerado um promissor agente antioxidante e exibir propriedades anti-aterogênicas in vitro.

Em trabalhos anteriores, mostrou-se que uma nanoemulsão lipídica denomi-nada LDE após injeção endovenosa, em pacientes com carcinoma mamário e outros tumores sólidos concentra-se nos tecidos neoplásicos e pode direcionar especificamente agentes quimioterápicos ao tumor. Estudos clínicos mostraram que a LDE diminui acentuadamente os efeitos tóxicos desses agentes e em estudos com animais de experimentação não reduz seus efeitos antitumorais. No presente estudo, testamos a hipótese de a LDE injetada por via locorregional poderia concentrar-se no tumor de mama e nos linfonodos axilares da mama comprometida, visando futuras aplica-ções do sistema na quimioterapia neoadjuvante desse tumor. Três técnicas de injeção da LDE foram testadas em pacientes com carcinoma de mama avançado com tratamento cirúrgico pré-programado. A LDE marcada com colesterol radioativo foi injetada 12 horas antes da cirurgia, nas pacientes divididas em três grupos: Grupo 1 (G1, n=4): LDE injetada no parênquima mamário, a 5 cm da lesão ; Grupo 2 (G2, n=4): LDE injetada na região peri-tumoral; e Grupo 3 (G3 n=6): LDE injetada em região intratumoral. Este grupo foi subdividido em 2: em 2 pacientes realizaram cirurgia 2hs após a injeção da LDE e nas outras 4, 12hs após a injeção da LDE. Quantificou-se a capta-ção da LDE nos fragmentos de tecido tumoral e mamário normal e do linfonodo axilar retirados durante a cirurgia por contagem de radioatividade após extração lipídica dos tecidos. Os resultados evidenciaram que, em G1, houve maior captação da LDE em tecido normal, sugerindo se tratar de metodologia ina-dequada. Em G2, a captação da LDE foi quatro vezes maior no tecido tumo-ral do que no tecido normal, próximo, portanto, dos valores encontrados em estudos anteriores que utilizaram a injeção da LDE por via hematológica. Em G3, o valor médio de captação da LDE foi 53 vezes maior no tecido tumoral (>75%), com mínima captação pelo tecido mamário normal (<8%). A injeção intratumoral da LDE mostrou-se, portanto, metodologia ainda superior à inje-ção da LDE por via endovenosa para a utilização efetiva dessa nanoemulsão como terapia-alvo em tumores primários de mama. / In previous work had showed that a lipidic nanoemulsion called LDE after intravenous injection in patients with breast carcinoma and others solid tumors focuses in the neoplasic tissue and can target especially chemotherapist agents to the tumors. Clinical studies showed that LDE decreases the toxic effects of those agents and in studies with experimental animals don\'t reduce yours antitumoral effects. In the present study, we had test the hypothesis of the LDE injected by locoregional could focuses in the breast tumor and in the axillary lymph node of the compromised breast, targeting future applications of the system in the neoadjuvant chemotherapy of this tumor. Three techniques of injection of the LDE had test in patients with advanced breast carcinoma with sirurgic treatment pre-programmed. The LDE marked with radioactive cholesterol was injected 12 hours before the surgery, in patients divided in three groups: Group 1 (G1, n=4): LDE injected in the breast parenchyma, about 5 cm of the lesion; Group 2 (G2, n=4): LDE injected in the peritumoral region; and Group 3 (G3, n=6): LDE injected in the intratumoral region. This group was subdivided in 2: in 2 patients had realized surgery 2 hs after the injection of LDE and in the others 4 patients 12hs after the injection of LDE. It had quantified the capture of LDE in the fragments of the tumoral and breast tissue and of the axillary lymph node withdrawn during the surgery by counting of radioactive after lipidic extraction of this tissue. The results showed that, in G1, there was greater capture of LDE in normal tissue, suggesting it is an inappropriate methodology. In G2, the capture of LDE was four times higher in the tumoral tissue than in the normal tissue, closer, therefore, of the values found in previous studies that used the injection of LDE by hematology. In G3, the medium value of capture of LDE was 53 times higher in the tumoral tissue (> 75%), with minimum capture by the normal breast tissue (< 8%). The intratumoral injection of LDE showed, therefore, methodology still higher than the intravenous injection of LDE by intravenous for the effective use of this nanoemulsion as therapy target in primary tumors of breast.

O efeito do fotossensibilizador na estrutura biológica não é apenas influenciado por suas propriedades fotofísicas, mas também por sua interação específica com biosistemas.Além disso, a localização do fotossensibilizador no tecido tumoral é um importante fator que resulta em diferentes mecanismos de destruição do tumor. Muitos fotossensibilizadores, após administração sistêmica, se ligam às proteínas plasmáticas e com isso são distribuídos em diferentes sítios no organismo. Os fotossensibilizadores hidrofílicos são largamente transportados por albuminas e globilinas e se acumulam preferencialmente no estroma vascular dos tumores. Entretanto, fotossensibilizadores mais hidrofóbicos se ligam às lipoproteínas, principalmente LDL, que promove a entrada do FS na célula através de endocitose mediado por receptor. Sendo assim, a localização do FS depende de sua ligação com as deferentes proteínas plasmáticas, sua farmacocinética e também é influenciada pela diferença entre o tecido normal e tumoral. O tecido tumoral tem pH mais baixo e maior expressão de receptores de LDL do que os tecidos normais, aumentando a seletividade dos FSs as células tumorais. A incorporação de FS hidrofóbicos em lipossomas para a administração sistêmica pode realçar ao transporte deste pelas lipoproteínas. No presente trabalho estudou-se a influência do pH na interação de fotossensibilizadores com lipossomas de DMPC e LDL. Os fotossensibilizadores utilizados nesse estudo foram Photofrin®, Photogem® e Photosan® que são derivados de hematoporfirinas. A metodologia empregada constitui de variação das concentrações de DMPC e LDL para os seguintes valores de pHs 5,0; 7,4 e 9,0, esse último pH utilizou-se somente para DMPC. O complexo FS - DMPC foi obtido por incubação dos FSs na concentração de 10 micro g.mL-1 com diferentes concentrações de DMPC (0 a 400 micro M) por trinta minutos no escuro. Isolou-se o LDL do plasma humano por ultracentrifugação por gradiente de densidade. Após a separação, o complexo FS - LDL foi obtido por incubação (12 horas no escuro) do FS na concentração 10 micro g.mL-1 com diferentes concentrações de LDL (0 a 0,04 micro M). O comportamento desses complexos foi analisado por espectroscopia de absorção ótica e por espectroscopia de fluorescência. / The effect of a photosensitizing compound on biological structures is governed not only by its photophysical properties but also by the specificity of its interaction with biosystems. Moreover, localization of the photosensitizer in the tumor tissue is an important factor affecting the outcome as well as mechanism leading to tumor destruction. Following administration, most photosensitizers are bound to blood components and delivered to different sites in the organism. It is generally accepted that hydrophilic photosensitizers are largely transported by albumins and globulins and mainly accumulate in the vascular stroma of tumors. More hydrophobic sensitizers are bound to lipoproteins, which promote drug internalization by cells through endocytosis of the lipoprotein carrier. In this way, uptake and localization depend on the initial plasma binding and the plasma pharmacokinetics of the drug. However, the selective localization of some photosensitizers are influence for the difference between malignant and normal tissues. Notably, the lower pH of the microenvironment usually found in the tumor tissue and the expression of greater number of LDL receptors on the surface of the tumor cells might influence cellular uptake. Delivery to lipoproteins or target tissues may be facilitated and enhanced by the incorporation of lipophilic photosensitizers into liposomes for systemic administration. In the present work we have studied the pH-dependence of the interaction of photosensitizers with DMPC liposomes and low density lipoprotein (LDL). The photosensitizers used in this study are Photofrin®, Photogem® and Photosan®, which are hematoporphyrin derivates. The methodology used to this work, constitute of various concentrations of DMPC liposomes and LDL at different pH values. It were used the 5,0; 7,4 and 9,0 pH values. The DMPC-drug complexes were obtained by incubation of the photosensitizers 10 _g.mL-1 with differents DMPC concentrations for 30 min in the dark. The LDL was isolated from human plasma by sequential density gradient ultracentrifugation. The LDL-drug complexes were obtained by incubation of the photosensitizers 10 _g.mL-1 with differents LDL concentrations. The incubation was performed in a water bath at 20_C for 12 hours in the dark. The comportment of the complexes was analyzed by fluorescence spectroscopy and UV-visible spectroscopy.

Introdução: O Diabetes mellitus (DM) está associado a complicações crônicas micro e macrovasculares. A medida da hemoglobina glicada (HbA1c) avalia o grau do controle glicêmico em pacientes diabéticos e seus níveis são capazes de prognosticar o risco de desenvolvimento dessas complicações. Entre as origens das complicações causadas pela hiperglicemia, há a hipótese dos produtos finais de glicação avançada (AGEs) e do estresse oxidativo. A reação de glicação não enzimática das proteínas também está relacionada com as complicações diabéticas e é responsável pela formação da HbA1c. Entretanto, tem sido demonstrado um aumento dessa glicação em pacientes não diabéticos. Um dos prováveis mecanismos para esse aumento é a peroxidação lipídica, com conseqüente aumento nos níveis de malondialdeído (MDA) que modifica a apolipoproteína B (APO B) do colesterol de baixa densidade (LDL). A modificação oxidativa do LDL confere propriedades específicas pró-aterogênicas. A presença do LDL oxidado e o aumento da tendência do LDL à peroxidação lipídica, podem contribuir para o aumento dos níveis de HbA1c. Objetivo: Verificar a associação entre os níveis de HbA1c com o Colesterol LDL e LDL oxidado em Indivíduos não-diabéticos. Métodos: Foi realizado um estudo transversal observacional, no qual um total de 196 indivíduos, classificados como não-diabéticos, foram analisados e divididos em três grupos, conforme os valores de HbA1c e glicemia de jejum (GJ): Grupo 1 (n =64) - HbA1c <5,7% e GJ <100 mg/dL; Grupo 2 (n =69) - HbA1c ≥5,7 e ≤6,4% e GJ <100 mg/dL; Grupo 3 (n =63) - HbA1c ≥5,7 e ≤6,4% e GJ ≥100 e <126mg/dL. Amostras de sangue total e soro foram coletadas. O LDL oxidado foi medido por método imunoensaio enzimático (Mercodia ®), ApoB dosada por imunoturbidimentria, a relação Colesterol LDL(oxi)/Colesterol-HDL foi estimada, além das outras dosagens bioquímicas do perfil lipídico. Esses testes foram comparados e analisados entre os três diferentes grupos. Resultados: Houve diferença significativa nos níveis de LDL(oxi) (p< 0,001), Apo B (p= 0,026) e razão LDL(oxi)/HDL (p< 0,001) entre os três grupos. Os valores de HbA1c apresentaram correlação positiva com os valores de LDL (oxi) (r =0,431; p <0,001), LDL (r =0,148; p =0,039), Col Não-HDL (r =0,192; p =0,007) e Apo B (r =0,171; p <0,001). Estas associações positivas permaneceram significativas, mesmo após ajuste, por análise de regressão linear múltipla para as variáveis álcool, medicamentos, índice de massa corporal (IMC) e idade. Também apresentaram correlações positivas com os valores de HbA1c: razão LDL (oxi)/HDL (r =0,422; p <0,001), CT (r =0,142; p =0,048), triglicerídios (r =0,155; p =0,030) e IMC (r =0,263; p <0,001). Conclusão: Nosso estudo demonstrou associação dos níveis de HbA1c com as partículas lipídicas aterogênicas LDL, Apo B, colesterol não HDL e LDL (oxi). Os níveis de LDL, principalmente LDL (oxi), estão significativamente associados com os níveis de HbA1c e glicose, mesmo em indivíduos não-diabéticos. Os indivíduos classificados com alto risco de desenvolver DM ou DCV apresentam valores mais elevados de partículas de LDL oxidadas. Nossos dados sugerem que a presença de LDL (oxi) está relacionada com a glicação e ao aumento dos níveis sanguíneos de HbA1c em indivíduos não diabéticos. / Background: Diabetes mellitus (DM) is associated with chronic microvascular and macrovascular complications. The measurement of glycated hemoglobin (HbA1c) assesses the degree of glycemic control in diabetics patients and their levels are able to predict the risk of developing these complications. The formation of advanced glycation and products (AGEs) and oxidative stress are some of the hypothesis described to explain the diabetic complications. The reaction of nonenzymatic glycation of proteins is also related to these complications and is responsible for the formation of HbA1c. However, it has been shown an increase in glycation in nondiabetic patients, which is maybe due to lipid peroxidation, consequently, the levels of malondialdehyde (MDA) increase and there is modifications in the apolipoprotein B (apoB) of low-density cholesterol (LDL). The oxidative modification of LDL confers specific proatherogenic properties. The presence of oxidized LDL and an increased tendency to LDL peroxidation contribute to increased levels of HbA1c in diabetic patients. Objective: To investigate the association between HbA1c levels and the levels of LDL cholesterol and oxidized LDL in subjects without diabetes. Methods: We conducted an observational cross-sectional study in which a total of 196 individuals, classified as non-diabetics, were analyzed and divided into three groups according to the values of HbA1c and fasting plasma glucose (FPG): Group 1 (n = 64) - HbA1c <5.7% and FPG <100 mg / dL, Group 2 (n = 69) - HbA1c ≥ 5.7 and ≤ 6.4% and FPG <100 mg / dL, Group 3 (n = 63) - HbA1c ≥ 5.7 and ≤ 6.4% and FPG ≥ 100 and <126mg/dL. Samples of whole blood and serum were collected. Oxidized LDL was measured by enzyme immunoassay method (Mercodia ®), ApoB was measured by imunoturbidimentria and the ratio LDL cholesterol (oxi) / HDL-cholesterol was estimated. Other biochemical measurements of lipid profile were also carried out. Results: There were significant differences in LDL (oxi) (p <0.001), Apo B (p = 0.026), and ratio LDL (oxi) / HDL (p <0.001) between the three groups. HbA1c values showed positive association with LDL (oxi) (r = 0.431, p <0.001), LDL (r = 0.148, p = 0.039), non-HDL Col (r = 0.192, p = 0.007) and Apo B (r = 0.171, p <0.001). These positive associations remained significant even after adjustment for multiple linear regression analysis for variables such as alcohol, drugs, BMI and age. The ratio LDL (oxi) / HDL (r = 0.422, p <0.001), CT (r = 0.142, p = 0.048), triglycerides (r = 0.155, p = 0.030) and BMI (r = 0.263, p <0.001) also showed positive correlations with HbA1c values. Conclusions: Our study demonstrated that there is association between HbA1c levels and the atherogenic lipid particles LDL, Apo B, non-HDL cholesterol and LDL (oxi). LDL levels, especially LDL (oxi), are significantly associated with HbA1c and glucose levels, even in non-diabetics. Individuals classified with high risk of developing diabetes or CVD have higher levels of oxidized LDL particles. Our data suggest that the presence of LDL (oxi) is related to glycation and increased blood levels of HbA1c in nondiabetic individuals.

Introdução: O Diabetes mellitus (DM) está associado a complicações crônicas micro e macrovasculares. A medida da hemoglobina glicada (HbA1c) avalia o grau do controle glicêmico em pacientes diabéticos e seus níveis são capazes de prognosticar o risco de desenvolvimento dessas complicações. Entre as origens das complicações causadas pela hiperglicemia, há a hipótese dos produtos finais de glicação avançada (AGEs) e do estresse oxidativo. A reação de glicação não enzimática das proteínas também está relacionada com as complicações diabéticas e é responsável pela formação da HbA1c. Entretanto, tem sido demonstrado um aumento dessa glicação em pacientes não diabéticos. Um dos prováveis mecanismos para esse aumento é a peroxidação lipídica, com conseqüente aumento nos níveis de malondialdeído (MDA) que modifica a apolipoproteína B (APO B) do colesterol de baixa densidade (LDL). A modificação oxidativa do LDL confere propriedades específicas pró-aterogênicas. A presença do LDL oxidado e o aumento da tendência do LDL à peroxidação lipídica, podem contribuir para o aumento dos níveis de HbA1c. Objetivo: Verificar a associação entre os níveis de HbA1c com o Colesterol LDL e LDL oxidado em Indivíduos não-diabéticos. Métodos: Foi realizado um estudo transversal observacional, no qual um total de 196 indivíduos, classificados como não-diabéticos, foram analisados e divididos em três grupos, conforme os valores de HbA1c e glicemia de jejum (GJ): Grupo 1 (n =64) - HbA1c <5,7% e GJ <100 mg/dL; Grupo 2 (n =69) - HbA1c ≥5,7 e ≤6,4% e GJ <100 mg/dL; Grupo 3 (n =63) - HbA1c ≥5,7 e ≤6,4% e GJ ≥100 e <126mg/dL. Amostras de sangue total e soro foram coletadas. O LDL oxidado foi medido por método imunoensaio enzimático (Mercodia ®), ApoB dosada por imunoturbidimentria, a relação Colesterol LDL(oxi)/Colesterol-HDL foi estimada, além das outras dosagens bioquímicas do perfil lipídico. Esses testes foram comparados e analisados entre os três diferentes grupos. Resultados: Houve diferença significativa nos níveis de LDL(oxi) (p< 0,001), Apo B (p= 0,026) e razão LDL(oxi)/HDL (p< 0,001) entre os três grupos. Os valores de HbA1c apresentaram correlação positiva com os valores de LDL (oxi) (r =0,431; p <0,001), LDL (r =0,148; p =0,039), Col Não-HDL (r =0,192; p =0,007) e Apo B (r =0,171; p <0,001). Estas associações positivas permaneceram significativas, mesmo após ajuste, por análise de regressão linear múltipla para as variáveis álcool, medicamentos, índice de massa corporal (IMC) e idade. Também apresentaram correlações positivas com os valores de HbA1c: razão LDL (oxi)/HDL (r =0,422; p <0,001), CT (r =0,142; p =0,048), triglicerídios (r =0,155; p =0,030) e IMC (r =0,263; p <0,001). Conclusão: Nosso estudo demonstrou associação dos níveis de HbA1c com as partículas lipídicas aterogênicas LDL, Apo B, colesterol não HDL e LDL (oxi). Os níveis de LDL, principalmente LDL (oxi), estão significativamente associados com os níveis de HbA1c e glicose, mesmo em indivíduos não-diabéticos. Os indivíduos classificados com alto risco de desenvolver DM ou DCV apresentam valores mais elevados de partículas de LDL oxidadas. Nossos dados sugerem que a presença de LDL (oxi) está relacionada com a glicação e ao aumento dos níveis sanguíneos de HbA1c em indivíduos não diabéticos. / Background: Diabetes mellitus (DM) is associated with chronic microvascular and macrovascular complications. The measurement of glycated hemoglobin (HbA1c) assesses the degree of glycemic control in diabetics patients and their levels are able to predict the risk of developing these complications. The formation of advanced glycation and products (AGEs) and oxidative stress are some of the hypothesis described to explain the diabetic complications. The reaction of nonenzymatic glycation of proteins is also related to these complications and is responsible for the formation of HbA1c. However, it has been shown an increase in glycation in nondiabetic patients, which is maybe due to lipid peroxidation, consequently, the levels of malondialdehyde (MDA) increase and there is modifications in the apolipoprotein B (apoB) of low-density cholesterol (LDL). The oxidative modification of LDL confers specific proatherogenic properties. The presence of oxidized LDL and an increased tendency to LDL peroxidation contribute to increased levels of HbA1c in diabetic patients. Objective: To investigate the association between HbA1c levels and the levels of LDL cholesterol and oxidized LDL in subjects without diabetes. Methods: We conducted an observational cross-sectional study in which a total of 196 individuals, classified as non-diabetics, were analyzed and divided into three groups according to the values of HbA1c and fasting plasma glucose (FPG): Group 1 (n = 64) - HbA1c <5.7% and FPG <100 mg / dL, Group 2 (n = 69) - HbA1c ≥ 5.7 and ≤ 6.4% and FPG <100 mg / dL, Group 3 (n = 63) - HbA1c ≥ 5.7 and ≤ 6.4% and FPG ≥ 100 and <126mg/dL. Samples of whole blood and serum were collected. Oxidized LDL was measured by enzyme immunoassay method (Mercodia ®), ApoB was measured by imunoturbidimentria and the ratio LDL cholesterol (oxi) / HDL-cholesterol was estimated. Other biochemical measurements of lipid profile were also carried out. Results: There were significant differences in LDL (oxi) (p <0.001), Apo B (p = 0.026), and ratio LDL (oxi) / HDL (p <0.001) between the three groups. HbA1c values showed positive association with LDL (oxi) (r = 0.431, p <0.001), LDL (r = 0.148, p = 0.039), non-HDL Col (r = 0.192, p = 0.007) and Apo B (r = 0.171, p <0.001). These positive associations remained significant even after adjustment for multiple linear regression analysis for variables such as alcohol, drugs, BMI and age. The ratio LDL (oxi) / HDL (r = 0.422, p <0.001), CT (r = 0.142, p = 0.048), triglycerides (r = 0.155, p = 0.030) and BMI (r = 0.263, p <0.001) also showed positive correlations with HbA1c values. Conclusions: Our study demonstrated that there is association between HbA1c levels and the atherogenic lipid particles LDL, Apo B, non-HDL cholesterol and LDL (oxi). LDL levels, especially LDL (oxi), are significantly associated with HbA1c and glucose levels, even in non-diabetics. Individuals classified with high risk of developing diabetes or CVD have higher levels of oxidized LDL particles. Our data suggest that the presence of LDL (oxi) is related to glycation and increased blood levels of HbA1c in nondiabetic individuals.

Orientador: Helena Coutinho Franco de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T07:10:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dorighello_GabrielGabriel_M.pdf: 3431763 bytes, checksum: b48a104c7ef2b201c52d6118e59cdb85 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A aterosclerose é uma das principais doenças causadoras de morbidade e mortalidade nas populações ocidentais. Uma das teorias mais consistentes para explicar os mecanismos celulares e moleculares da aterogênese é a chamada "hipótese oxidativa", que aponta a oxidação da LDL como evento central na gênese e no desenvolvimento das lesões. Recentemente demonstramos que camundongos geneticamente deficientes do receptor de LDL (LDLR0), modelo da hipercolesterolemia familiar humana, apresentam disfunção mitocondrial em vários tecidos, o que pode ser altamente relevante para o processo aterosclerótico. As mitocôndrias destes animais apresentam aumento de geração de espécies reativas de oxigênio (EROS) devido à diminuição de seu conteúdo de NADPH, principal poder redutor para reconstituição de seu sistema enzimático antioxidante. Propusemos que o consumo deste poder redutor do NADPH era conseqüência de uma esteroidogênese aumentada nos tecidos dos camundongos LDLR0. A deficiência mitocondrial de substratos dependentes de NADPH foi confirmada e tratamentos in vitro com isocitrato e in vivo com citrato corrigiram parcialmente o estresse oxidativo mitocondrial destes animais. Neste projeto investigamos, se o aumento de produção de EROS mitocondrial e a severidade da aterosclerose em camundongos LDLR0 poderiam ser corrigidos ou reduzidos por: 1- reposição de substratos dependentes de NADPH (citrato), e 2- tratamento com o antioxidante Vimang®, o qual tem efeito protetor em mitocôndrias desafiadas com pró-oxidantes. Em ambos os estudos utilizamos 2 protocolos de investigação das lesões ateroscleróticas: lesão induzida por dieta rica em colesterol e lesão espontânea (dieta comercial livre de colesterol). Os animais tratados com alta concentração de citrato (120 mM) e dieta com colesterol apresentaram aumento na área das lesões ateroscleróticas da raiz da aorta. Com relação às lesões espontâneas, tratamentos por longo prazo com citrato diluído (2.44 mM) ou pravastatina (10 mg/Kg), isoladamente, não tiveram efeito, enquanto a combinação de citrato+pravastatina aumentou o tamanho médio das lesões ateroscleróticas (4 vezes em relação ao grupo não tratado, p<0.05). A produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) não diferiu em mitocôndrias de fígado dos 4 grupos, e foi mais elevada nos linfócitos de baço do grupo tratado com pravastatina. Os camundongos tratados por 2 semanas com o antioxidante Vimang® e alimentados com dieta enriquecida com colesterol, apresentaram diminuição nas concentrações plasmáticas e hepáticas de colesterol, no entanto a área de lesão aterosclerótica não diminuiu significativamente. Nos estudos com Vimang® em longo prazo e dieta isenta de colesterol foram verificados efeitos benéficos de redução de colesterolemia e da produção de EROS pelos linfócitos. No entanto, houve aumento do tamanho das lesões ateroscleróticas espontâneas. Análises de correlação univariadas com o estudo citrato, Vimang® e o conjunto de dados de ambos estudos mostraram que o tamanho médio das lesões aórticas se correlaciona positivamente com as concentrações plasmáticas de colesterol, de triglicérides, da enzima hepática fosfatase alcalina, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), e com velocidade de oxidação de NADPH e de produção de EROS pelas mitocôndrias hepáticas, mas não com a produção de EROS pelos linfócitos do baço. Análises multivariadas demonstraram a importância dos lipídeos plasmáticos e da produção de EROS mitocondrial hepático na severidade da aterosclerose em relação aos outros parâmetros. Análise de correlação ajustada pelos valores de colesterol e triglicérides evidenciou a contribuição significativa e independente dos parâmetros indicadores de estresse oxidativo mitocondrial hepático na formação da lesão de aterosclerose. A partir destes resultados, propusemos como hipótese que o estresse oxidativo hepático tem um papel central no mecanismo de formação da lesão vascular neste modelo. Tal conexão se daria através da secreção hepática de fatores pró-aterogênicos, os quais poderiam ser de natureza inflamatória ou metabólica. / Abstract: Atherosclerosis is a major cause of morbidity and mortality in the Western World. One of the main theories to explain atherogenesis is named "oxidative hypothesis". Accordingly, LDL oxidation is a central event in the genesis and development of atherosclerotic lesions. Recently, we demonstrated that LDL receptor deficient mice (LDLR0) present mitochondrial dysfunction in several tissues, which may be relevant to atherogenesis. The mitochondria of these animals present increased reactive oxygen species (ROS) generation due to decreased NADPH content, the main reducing power for the antioxidant enzymatic system. We proposed that consumption of NADPH (in the reduced state) content was a consequence of elevated steroidogenesis in the LDLR0 mice tissues. The mitochondrial deficiency of NADPH dependent substrates was directly confirmed, and isocitrate (in vitro) and citrate (in vivo) treatments partially corrected the mitochondrial oxidative stress in this model. In this project we studied whether the increase of mitochondrial ROS production and the atherosclerosis severity in the LDLR0 mice could be corrected or diminished by: 1- NADPH dependent substrates replacement (citrate), and 2- treatment with the antioxidant Vimang®, which has protective effect against pro-oxidants in mitochondria. In both studies we used 2 protocols to study atherosclerotic lesions: high cholesterol diet-induced lesion and spontaneous developed lesions (diet without cholesterol). Animals treated with high concentration of citrate (120 mM) and high cholesterol diet presented increased aorta atherosclerotic lesion areas. Regarding the spontaneous lesions study, chronic treatments with diluted citrate (2.44 mM) or pravastatin (10 mg/Kg) isolated did not affect, while the citrate+pravastatin combination increased the mean atherosclerotic lesion size (4 fold, p<0,05). The liver mitochondrial ROS production was similar among the 4 groups, and was elevated in the spleen lymphocytes of pravastatin treated group. Mice treated during 2 weeks with Vimang® and fed with high cholesterol diet presented decreased plasma and liver cholesterol levels; however the atherosclerotic lesion area was not reduced. In the Vimang® chronic studies with no dietary cholesterol, beneficial effects were verified, i.e., reduction in the plasma cholesterol and lymphocytes ROS production rate. However, the spontaneous atherosclerotic lesions were significantly enhanced. Univariate correlation analysis showed that the aorta lesion size was positive and significantly correlated with plasma cholesterol, triglycerides, alkaline phosphatase, TBARS and hepatic mitochondrial NADPH oxidation and ROS production, but not with lymphocyte ROS production. By multivariate analysis only plasma lipids and hepatic mitochondrial ROS production were significantly related with atherosclerotic lesion area. Partial (adjusted for cholesterol and triglycerides) correlation analysis evidenced that hepatic mitochondrial oxidative stress was independently correlated with atherosclerosis development. Thus, we hypothesize that the hepatic oxidative stress has a central role in the mechanism of vascular lesion formation in this animal model. The connection could occur through hepatic secretion of pro-atherogenic inflammatory or metabolic factors. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

As doenças cardiovasculares ainda são as principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo. E a aterosclerose é uma das principais precursoras de vários desfechos clínicos como isquemias e infarto do miocárdio. As placas ateroscleróticas se desenvolvem preferencialmente em regiões de bifurcação ou curvatura dos vasos, onde o shear stress (SS) encontra-se diminuído ou perturbado. A expressão de proteínas pró-aterogênicas em regiões de baixo SS e ateroprotetoras em regiões de SS alto foram relatadas na literatura, porém o mecanismo completo carece de elucidação. Este trabalho teve por objetivo integrar proteômica e metabolômica para um melhor entendimento das alterações moleculares que acontecem nas células endoteliais em situações de alto e baixo SS, que podem resultar no desenvolvimento de lesões e placas ateroscleróticas. Para esta finalidade, células endoteliais foram submetidas a alto e baixo SS em sistema cone plate, seguido de análise proteômica e metabolômica por espectrometria de massas. Nossos dados demonstraram que o metabolismo de lipídio e metabolismo de modificações pós-traducionais de proteínas (N-glicosilações) estavam diminuídos em baixo SS. Em relação ao metabolismo de lipídio, foi identificada diminuição na concentração de ácidos graxos e na expressão de enzimas e proteínas transportadoras de lipídios em células sob baixo SS. O receptor de LDL, proteína importante para a homeostase do colesterol, foi identificado em menor concentração na membrana, bem como com alteração no seu perfil de glicosilação em células após baixo SS. As células submetidas a baixo SS e, portanto, aquelas com perfil pró-aterogênico, quando tratadas com estatina para o aumento da expressão de LDLR, aproximaram seu fenótipo ao de células submetidas a alto SS, adquirindo parte de um fenótipo ateroprotetor, com recuperação dos níveis de aminoácidos, lipídios, açúcares e ácidos carboxílicos. Os dados deste trabalho sugerem que o metabolismo de lipídios é um processo importante na manutenção do perfil ateroprotetor de células submetidas a alto SS. Além disso, as evidências demonstraram que estatinas apresentam uma atividade protetora, não apenas sistêmica, com diminuição do LDL circulante, mas também no microambiente vascular, contribuindo para o bom funcionamento das células endoteliais / Cardiovascular diseases are the main cause of the mortality and morbidity worldwide. Atherosclerotic plaque development is closely associated to the hemodynamic forces applied to endothelial cells (EC). Among these, shear stress (SS) plays a key role in disease development since changes in flow intensity and direction could stimulate an atheroprone or atheroprotective phenotype. EC under low and/or oscillatory SS (LSS) have upregulation of inflammatory proteins, adhesion and cellular permeability molecules. On the contrary, cells under high/laminar SS (HSS) increase their expression of protective and anti-inflammatory factors. The mechanism behind the SS regulating an atheroprotective phenotype is not completely elucidated. Here we used proteomics and metabolomics to better understand the changes suffered by endothelial cells under LSS and HSS that promote the atheroprone and atheroprotective profile and how these modifications can be connected to atherosclerosis development. Our data showed that lipid metabolism and post translational modification protein metabolism were downregulated in cells under LSS. About lipid metabolism, we found the LDLR, one important protein in cholesterol homeostasis, showed significant alterations both at the quantitative expression level, as well as regarding post-translational modifications. Under LSS, LDLR was seem at lower concentrations and with a different glycosylation profile. Finally, modulating LDLR with atorvastatin led to the recapitulation of an HSS metabolic phenotype in EC under LSS. The phenotype was recovery based on increasing of amino acids, lipids, sugars and carboxylic acids. Altogether, our data suggest lipid metabolism is important in atheroprotective phenotype of endothelial cells under HSS. Statins showed benefits not only systemic, decreasing cholesterol level in blood, but also in vascular environment, contributing for protector phenotype of endothelial cells

Introdução: Dentre as diversas formas modificadas da lipoproteína de baixa densidade (LDL), a LDL eletronegativa, LDL (-), contribui para o processo aterosclerótico, promovendo o recrutamento leucocitário para a intima arterial e modulando a resposta inflamatória. Mimotopos são moléculas que podem se ligar à porção variável de um anticorpo, a enzimas ou a receptores. Os peptídeos mimotopos da LDL (-) são moléculas capazes de mimetizar a conformação de epítopos expostos apenas quando a LDL sofre modificações in vivo. Objetivo: Avaliar os efeitos de peptídeos mimotopos da LDL(-), previamente selecionados pela técnica de phage display e denominados p1A3 e p2C7, em células endoteliais e macrófagos. Metodologia: Avaliou-se a atividade dos peptídeos mimotopos sobre a expressão de RNAm de genes relacionados tanto à ativação quanto à disfunção endotelial, assim como a atividade citotóxica e a captação dos peptídeos por células endoteliais (HUVEC, HAEC e EA.Hy 926). Verificou-se também a atividade pró-inflamatória dos peptídeos em cultura primária de macrófagos murinos derivados da medula óssea (BMDM), investigando-se a ativação do complexo proteico inflamassoma, assim como a internalização dos peptídeos por essas células, utilizando citometria de fluxo e microscopia confocal. Resultados: As células endoteliais e os macrófagos internalizaram os peptídeos mimotopos p1A3 e p2C7. Nos macrófagos houve inibição (50%) da internalização dos peptídeos p1A3 e p2C7 na presença de brefeldina A, indicando que esses peptídeos são majoritariamente captados por endocitose independente de clatrina. Nas células HAEC, observou-se 25% de inibição da captação de ambos os peptídeos se bloqueando o receptor scavenger LOX-1 com anticorpo anti-LOX-1. Quanto à atividade citotóxica, observou-se acentuada redução na atividade mitocondrial das células endoteliais EA.Hy 926 e HAEC apenas com o peptídeo p1A3, não sendo observada citotoxicidade para os macrófagos tanto para p1A3 quanto p2C7 nas concentrações estudadas (12,5 a 200 ug/mL). Nos macrófagos, o peptídeo p2C7 induziu o aumento da expressão de RNAm de genes relacionados com a polarização para o fenótipo M1 (iNOS, TNF-&#945;, IL-1&#945;) e da produção de &#8226;NO, assim como, a ativação do sinal 1 (transcricional) do complexo proteico inflamassoma, o que também se observou para a LDL (-). O peptídeo p1A3 modulou a expressão gênica da linhagem HAEC, diminuindo a expressão de RNAm dos genes relacionados à proliferação celular (VEGFr1 e 2, TGF&#946;, PDGF&#946; e eNOS). Conclusão: Os peptídeos mimotopos p1A3 e p2C7 interagem com as células endoteliais e macrófagos de maneiras distintas. O p2C7 induz uma resposta pró-inflamatória em macrófagos, mimetizando a LDL (-), sugerindo assim, que esse peptídeo possa atuar como um DAMP (padrão molecular associado ao perigo) importante para o processo inflamatório da placa aterosclerótica. / Introduction: Among the different subtypes of modified low-density lipoprotein (LDL), the electronegative LDL [LDL (-)] contributes to the progression of atherosclerosis, promoting leukocyte recruitment into the arterial intima and modulating the inflammatory response. Mimotopes are molecules capable of binding to the variable portion of an antibody, to enzymes or receptors. The mimotope peptides of LDL (-) are molecules mimicking the conformation of epitopes exposed only when LDL undergoes in vivo changes. Objective: To evaluate the effects of two mimotope peptides of LDL (-), previously selected the by phage display and called p1A3 and p2C7, on endothelial cells and macrophages. Methodology: We evaluated the activity of the mimotope peptides on gene mRNA expression related to both the activation and endothelial dysfunction as well as the cytotoxic activity and uptake of peptides by endothelial cells (HUVEC, HAEC and EA.Hy 926). It was also investigated the pro-inflammatory activity of the peptides on murine primary macrophage derived from bone marrow (BMDM), evaluating the activation of the protein complex inflammasome, as well as the internalization of peptides by these cells by flow cytometry and confocal microscopy. Results: The endothelial cells and macrophages internalized both peptides. In macrophages, brefeldin A inhibited the internalization of p1A3 and p2C7 around 50%, indicating that these peptides are mostly taken up by clathrin-independent bulk endocytosis. In HAEC it was observed a 25 % inhibition of the uptake of both peptides by blocking the LOX scavenger receptor with an anti-LOX-1 antibody. In relation to cytotoxicity, a reduction on mitochondrial activity was induced by p1A3 peptide only in endothelial cells (EA.Hy 926 and HAEC). No cytotoxic activity was observed for p2C7 peptide in macrophages or endothelial cells at the studied concentration range (12.5 to 200 &#181;g/mL). In macrophages, the p2C7 peptide increased mRNA expression of genes related to the polarization to M1 phenotype (iNOS, TNF-&#945; and IL-1&#945;) and of &#8226;NO production, as well as, protein complex signal 1 activation (transcriptional) what was also observed for LDL (-). The p1A3 peptide modulated the expression of genes related with cell proliferation (VEGFr1 e 2, TGF?&#946;, PDGF&#946; and eNOS) in HAEC. Conclusion: The mimotope peptides p2C7 and p1A3 interact with the endothelial cells and macrophages by different ways. The p2C7 induces a pro-inflammatory response in macrophages, mimicking LDL (-), thus suggesting that this peptide can act as a DAMP (Damage-associated molecular pattern) important in the inflammatory process of atherosclerotic plaque.

Anticorpos (Ac) anti-oxLDL estão envolvidos no desenvolvimento da lesão aterosclerótica. Induzimos a produção desses Ac através da imunização com oxLDL. Avaliamos os perfis lipídico e de Ac anti-oxLDL e anti-pepD (pepD é um peptídeo derivado da apoB). Animais apoE-/- possuem maiores níveis de lípides sorológicos em comparação com animais C57Bl/6, exceção da HDL. A imunização oxLDL não alterou este perfil. A imunização aumentou os títulos dos Ac IgM, IgG e IgG1 anti-oxLDL. Animais C57Bl/6, mas não os apoE-/- tiveram aumento dos Ac IgM anti-pepD após a imunização. Acreditamos que o aumento de anticorpos IgG1 deve-se ao adjuvante usado. A aterosclerose pode ocorrer com maior freqüência, em indivíduos portadores de doenças renais crônicas. Para estudar essa interferência submetemos os animais a um modelo de isquemia e reperfusão renal (I/R). A I/R promoveu aumento da concentração de TG, podendo agravar a aterosclerose. O aumento de Ac IgG anti-oxLDL promovidos pela I/R sugere que o processo inflamatório desencadeado por este procedimento, aumenta a oxidação de LDL. Desta forma, concluímos que a I/R pode ser considerado um procedimento pró-aterosclerótico que não pode ser revertido pela imunização com oxLDL. / Oxidized LDL (oxLDL) antibodies (Ab) are involved in the development of the atherosclerotic lesion. We induced the formation of such Ab through immunization with oxLDL. We evaluate the lipids and antibody (anti-oxLDL and anti-pepD pep D is a peptide derived from apolipoprotein B) profile. The apoE-/- mice used have higher seric levels of most lipids than C57Bl/6 animals, the exception being HDL. The oxLDL immunization does not change this profile. The immunization increased anti-oxLDL Ab e IgM, IgG and IgG1 titers. Anti-pepD IgM Ab increased with immunization in C57Bl/6 animals only, and not in apoE-/-. We believe the increased IgG1 Ab due to the adjuvant used. Atherosclerosis has a higher incidence in individuals with chronic renal conditions. In order to study such interference, we submitted the animals to a renal ischemia and reperfusion model (I/R). The I/R procedure increased TG concentration, what can make atherosclerosis more severe. The increase in IgG anti-oxLDL antibody caused by I/R suggests that the inflammation process set by the procedure increases LDL oxidation. This way, we conclude that the I/R can be considered a pro-atherosclerotic procedure. The oxLDL immunization was not able to revert the atherogenic effect caused by I/R model.

Introdução: A doença cardiovascular é a principal causa de morbimortalidade precoce em todo o mundo, e responde por grande parte dos gastos dos recursos destinados aos programas de políticas públicas. Neste contexto, a dieta representa uma importante ferramenta na redução dos fatores de risco cardiovasculares. Tendo em vista que inúmeros estudos mostram que o consumo de ômega 9 ou alimento fonte modifica positivamente diversos fatores de risco cardiovascular clássicos, se torna importante avaliar seu efeito sobre propriedades físico-químicas da LDL e da HDL, marcadores cardiometabólicos e oxidativos em indivíduos brasileiros com diferentes níveis de risco cardiovascular. Objetivo: Avaliar o efeito do consumo de azeite de oliva sobre parâmetros cardiometabólicos clássicos e novos em indivíduos com diferentes níveis de risco cardiovascular. Métodos: O estudo foi do tipo clínico prospectivo, aleatorizado, placebo controlado, duplo cego baseado em intervenção nutricional. Indivíduos de ambos os sexos, distribuídos em grupos azeite de oliva (AO) e placebo (PL) receberam durante 8 semanas 3 g/d de azeite de oliva ou placebo. Todos os indivíduos foram classificados quanto ao risco cardiovascular, seguindo os critérios estabelecidos pelo Escore de Risco de Framingham (ERF). Nos momentos basal, T=4S e T=8S foram determinados o perfil clínico, antecedentes familiares de doenças, pressão arterial, consumo alimentar e nível de atividade física. A partir do plasma ou soro, obtidos após 12 h de jejum, foram determinados o perfil lipídico, as apolipoproteínas, o tamanho da HDL e da LDL, o conteúdo de LDL(-) e de NEFAS e atividade da paraoxonase. A aderência à intervenção foi monitorada por meios diretos (marcadores bioquímicos) e indiretos (registro de intercorrências). Resultados: O azeite de oliva foi efetivo em reduzir concentração de triacilglicerois dos indivíduos em alto risco cardiovascular (p=0,023 no T=4S e p=0,049 no T=8S) e a de LDL-C dos indivíduos com risco cardiovascular intermediário (p=0,045 no T=8S) no atual estudo. Observou-se também redução significativa na LDL(-), quando a amostra foi estratificada pelo ERF. Demais parâmetros permaneceram inalterados em função do tempo da intervenção e do ERF. Conclusão: Baixa suplementação (3 g/d) de azeite de oliva promoveu redução dos triacilglicerois, LDL-C e da LDL(-). Portanto, recomenda-se a incorporação de azeite de oliva na dieta brasileira ainda que em baixas doses. Sugere-se também que estudos adicionais usando doses maiores sejam realizados no sentido de identificar potenciais benefícios cardioprotetores adicionais associados ao consumo de azeite de oliva. / Introduction: Cardiovascular disease is the leading cause of premature morbidity and mortality worldwide, and accounts for a large part of the costs of resources devoted to public policy programs. In this context, the diet is an important tool in managing and reducing the risk of cardiovascular disease. Given that numerous studies show that consumption of omega 9 or food source changes positively several classical cardiovascular risk factors, it becomes important to evaluate its effect on physicochemical properties of LDL and HDL, cardiometabolic and oxidative markers in Brazilian individuals with different levels of cardiovascular risk. Objective: This study aimed to evaluate the effect of consuming olive oil on classical and new cardiometabolic properties in individuals with different levels of cardiovascular risk. Methods: It was a clinical, prospective, randomized, placebo controlled, double blind study based on nutritional intervention. Individuals of both sexes, divided into groups olive oil (AO) and placebo (PL) for 8 weeks received 3 g/d of olive oil or placebo. All subjects were classified for cardiovascular risk following the criteria established by the Framingham Risk Score (FRS). At baseline period, T = 4W and T = 8W the clinical profile, the family history of diseases, blood pressure, food consumption and physical activity level were determined. From plasma or serum obtained after 12 h of fasting lipid profile, apolipoproteins, the size of LDL and HDL, LDL (-) and NEFAS content, and activity of paraoxonase were determined. Adherence to the intervention was monitored by direct means (biochemical markers) and indirect (register of complications). Results: The olive oil was effective in reducing the concentration of triacylglycerol of individuals at high cardiovascular risk (p = 0.023 at T=4W and p=0.049 at T=8W) and LDL-C in individuals with intermediate cardiovascular risk (p=0.045 at T=8W) in the current study. It was also observed a significant reduction in LDL (-) when the sample was divided by the FRS. However, changes in other parameters were not detected when comparing the intervention group and the placebo group. Conclusion: Even at low dosage, olive oil has proved to be beneficial in reducing triglycerides, LDL-C and LDL (-).It is therefore recommended the incorporation of olive oil in the Brazilian diet even in low doses. It is suggested that future studies to use higher doses in order to check additional benefits associated with olive oil consumption.