Neutrophile Granulocyten wirken als einer der ersten Abwehrmechanismen gegen invasive Mikroorganismen im angeborenen Immunsystem von Mammalia. Aktiviert durch inflammatorische Signale verlassen diese Granulocyten das vaskuläre System und migrieren durch das Gewebe zum Infektionsherd. Dort binden sie die Mikroorganismen, phagozytieren und eliminieren diese schließlich mit hoher Effizienz. Humane Neutrophile Elastase (NE) ist Bestandteil der neutrophilen Granula und spielt eine entscheidende Rolle im Abbau von Virulenzfaktoren enteroinvasiver Bakterien, einschließlich der Shigella Virulenzfaktoren IpaB (invasion antigen plasmid B) und IcsA (intracellular spread A). NE gehört zu der Familie der Chymotrypsin-ähnlichen Serinproteasen, die sich durch Sequenz- und Strukurähnlichkeit auszeichnen, jedoch sehr unterschiedliche biologische Funktionen aufweisen. Cathepsin G (CG) ist wie NE eine Chymotrypsin-ähnliche Serinprotease und ebenfalls in neutrophilen Granula lokalisiert. Allerdings zeigt CG keine Aktivität gegenüber Virulenzfaktoren von Shigella. Obwohl die Kristallstrukturen von CG und NE fast identisch sind, konnten einzelne oder mehrere Aminosäuren in der Substratbindungsspalte identifiziert werden, die zwischen den beiden Enzymen differieren. Dies legte die Vermutung nahe, dass die Spezifität von NE gegenüber Virulenzfaktoren in diesen Unterschieden codiert sein könnte. Daher wurden diese Aminosäuren durch die analogen CG Aminosäuren oder durch Alanin ersetzt. Der Vergleich der funktionellen Eigenschaften der NE Mutanten mit wildtyp NE zeigte, dass die Aminosäuren an den Positionen 98 und 216-224 entscheidend für die Substratspezifität von NE sind. Die NE Mutanten N98A, 216-218 und 216-224 waren nicht mehr in der Lage, die Virulenzfaktoren IcsA und IpaB sowie das NE Peptidsubstrat abzubauen. Stattdessen haben diese Mutanten die Fähigkeit erlangt, das CG Peptidsubstrat abzubauen. Zusammenfassend konnten wir Aminosäuren in NE identifizieren, die sowohl die Spezifität von NE für das Peptidsubstrat als auch für die Virulenzfaktoren von Shigella flexneri determinieren. / Neutrophil granulocytes are one of the first lines of defense of the mammalian innate immune system against invading microorganisms. In response to inflammatory stimuli, neutrophils migrate from the blood stream to infected tissues where they bind, engulf and inactivate microorganisms efficiently. Human neutrophil elastase (NE), a neutrophil granule component, is a key host defense protein that rapidly destroys virulence factors of enteroinvasive pathogens including IpaB (invasion plasmid antigen B) and IcsA (intracellular spread A) from Shigella. NE belongs to the family of chymotrypsin-like serine proteases with sequence and structural similarity but with very different biological functions. Cathepsin G (CG) is another abundant chymotrypsin-like serine protease in neutrophil granules. However, in contrast to NE, CG does not cleave virulence factors of Shigella. The crystallographic structures of NE and CG are very similar but we identified single or multiple residues in the substrate-binding cleft to differ in these two enzymes. We hypothesized that NE specificity for bacterial virulence factors resides within these structural differences. Therefore these specific residues in NE were replaced with the analogous amino acids of CG or with alanine. By comparing the functional properties of these NE mutants to wildtype NE we were able to show that the amino acids at position 98 and 216-224 are crucial for the substrate specificity of NE. The NE mutants N98A, 216-218 and 216-224 did not cleave the virulence factors IcsA and IpaB as well as the NE peptide substrate but cleaved the CG peptide substrate. In summary, we identified residues in NE that determine the specificity of NE for the peptide substrate and for the Shigella flexneri virulence factors.

No description available.

Fragestellung und Zielsetzung: Ausgehend von dem Ziel, kommunikative Fähigkeiten von Studierenden der Humanmedizin objektiv zu messen, sollte in dieser Studie untersucht werden, ob eine ins Deutsche übersetzte Kurzversion des „Calgary-Cambridge Observation Guide for the Medical Interview“ (CCOG) von Kurtz und Silverman (1996) valide und reliabel ist und sich damit die Kommunikationsfähigkeit von Studierenden der Medizin bewerten lässt. Methode: Eine Auswahl von Ärzten, wissenschaftlichen Mitarbeitern und Studierenden des klinischen Studienabschnittes evaluierten im Abstand von mindestens drei Monaten fünf Anamnese-Videos mittels der ins Deutsche übersetzten „CCOG-Kurzversion“. Die Videos bestanden aus je einem Gespräch zwischen einem Studierenden des ersten klinischen Semesters in der Rolle des Arztes bzw. einer approbierten Ärztin und einem Schauspielpatienten – in unterschiedlicher Kommunikationsqualität. Die Auswertung erfolgte deskriptiv nach folgenden Kriterien: Bewertungszeitpunkt, Geschlecht bzw. Gruppe der Rater, Qualität der Videogespräche. Darüberhinaus wurden eine explorative und eine konfirmatorische Faktorenanalyse berechnet und die Retest-Reliabilität (Intra-Rater-Reliabilität) sowie die Intra-Class-Correlation (Inter-Rater-Reliabilität) bestimmt. Ergebnisse: 30 Rater beteiligten sich an der Studie, davon drei als sog. „Goldstan-dard“. Die Gesamtbewertung aller fünf Anamnese-Videos zeigte eine geringfügige Verbesserung in der Notenvergabe beim zweiten Bewertungszeitpunkt. In der Benotung waren professionelle Rater generell etwas strenger als Laien, Ärzte etwas strenger als Studierende und weibliche Rater etwas strenger als männliche. „Gold-standard“ und übrige Rater unterschieden sich bei einzelnen Items bis zu 1,6 Notenpunkten (z.B. beim Item „verbale/nonverbale Unterstützung des Patienten“). In der Originalversion enthält der CCOG 28 Items, die in sechs Skalen (mit jeweils 3 bis 7 Items) zusammengefasst sind. Diese Struktur ließ sich in der hier gerechneten Faktorenanalyse nur bedingt abbilden. Gemäß Eigenvalue > 1 genügten 5 Faktoren zur Abbildung bzw. Aufteilung der Items. Darüber hinaus zeigte sich eine andere Skalenzuordnung als im Original und über die Hälfte der Items (15/28) lud auf demselben Faktor. Auch die Inter-Rater-Übereinstimmung in der Beantwortung einzelner Items war nicht optimal (ICC-Range: 0,05 bis 0,57). Schlussfolgerungen: Die CCOG-Kurzversion zeigte relativ gute Übereinstimmun-gen bei der Retest-Reliabilität. Schwierigkeiten zeigten sich bei der Benotung einiger Items im Vergleich zwischen dem „Goldstandard“ und den übrigen Ratern. Die Skalen-Struktur der Items und die Inter-Rater-Reliabilität sind nur bedingt akzeptabel. Vielleicht hätte eine dreistufige Bewertungsskala oder eine homogene Rater-Gruppe oder auch eine bessere Schulung das Ergebnis der ICC verbessert. Es sollten einige Items gestrichen, sprachlich trennschärfer formuliert oder anders zusammengefasst, neue Items hinzugefügt und Skalen neu strukturiert werden.

Future connected vehicles will be able to warn about hidden dangers already before they are visible for the driver. With sight obstructions as one of the most common factors of accident causation, there is a huge potential to improve traffic safety. However, it is unclear how to design the human-machine-interface of such systems to effectively warn drivers about invisible dangers. Especially the expectation that such warnings will be comparably unreliable lead to conflicting demands on amount and coding of warning information. Earlier work shows that warnings that contain more specific information about a hazard can improve drivers understanding of and responses to warnings but they can also raise processing costs and delay reactions or even distract drivers. Psychological theories as well as related research indicates that augmented reality (AR) has the potential to improve warning effectiveness through optimized coding of additional information. AR warnings can inherently transmit the location of a hazard and – due to the corresponding approach of the referenced display towards the driver – could increases the salience of a warning. The general aim of this work is to understand the human factors of future communication-based collision warnings. Based on a theoretical analysis revealing the most relevant questions within that context, we conducted three driving simulator studies to understand the impact of AR warning design on the effectiveness of unreliable warnings about sight obstructed dangers. To consider not only short-term effectiveness, all studies contained several necessary as well as unnecessary warnings that were analyzed in detail. The first study with 88 participants investigated the benefit of prototypical AR warnings over unspecific warnings of different modalities (visual vs. auditory). Visual AR warnings showed advantages over the other warning designs in gaze and brake reaction times, passing speeds, collision rates and subjective evaluation. Auditory AR warnings did not reveal comparable effects. The second test with 80 participants examined the contribution of different design aspects of visual AR warnings. Adding specific warning symbols or scaling animations to the warnings showed some positive but rather inconsistent effects. In contrast, spatial referencing even of an unspecific warning symbol with AR consistently improved driver’s reactions and evaluations. A third experiment with 36 participants observed the differential effects of the spatial information per se and the coding of the information with AR. The warnings had either no spatial information, symbolically encrypted spatial information or AR encrypted spatial information. A higher amount of information consistently led to stronger brake reactions, higher trust and better subjective evaluation. Additionally, with AR encryption we observed faster fixations as well as brake reactions. The present research emphasizes the importance of specificity for warnings about hidden hazards and the potential of AR especially for in-vehicle warnings of future collision avoidance systems. The systematic analysis of psychological factors of warning design and the corresponding findings on their relative contribution to driver’s behavior might also be transferred to other domains and applications of warning and information design. / In naher Zukunft werden vernetzte Fahrzeuge bereits vor sichtverdeckten Gefahren warnen können, noch bevor diese für den Fahrer sichtbar sind. Da Sichtverdeckungen bei einem Großteil schwerer Verkehrsunfälle eine Rolle spielen, stellt dies ein großes Potenzial zur Erhöhung der Verkehrssicherheit dar. Unklar ist jedoch, wie die Mensch-Maschine- Schnittstelle solcher Systeme gestaltet werden sollte, um Autofahrer möglichst effektiv vor noch nicht sichtbaren Gefahren zu warnen. Insbesondere die Vorhersage, dass solche Systeme nur eine begrenzte Zuverlässigkeit haben werden, führt zu teilweise widersprüchlichen Anforderungen an Informationsmenge und Kodierung der Warnungen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Warnungen mit spezifischen Informationen über eine Gefahr einerseits Verständnis und Reaktionen der Fahrer auf die Warnungen verbessern, andererseits aber auch kognitiven Verarbeitungsaufwand und Reaktionszeiten erhöhen und ablenken können. Sowohl kognitionspsychologische Theorien als auch Studien aus unserem Forschungsgebiet deuten darauf hin, dass die Darstellungsprinzipien der erweiterten Realität (AR, für engl. augmented reality) das Potenzial bieten, die Effizienz solcher Warnungen durch eine optimierte Kodierung von Zusatzinformationen zu steigern. AR-Warnungen können inhärent die Position einer Gefahr übermitteln, ohne dass der Fahrer dazu eine abstrakte Repräsentation der Information auf die reale Umwelt übertragen muss. Das grundlegende Ziel der vorliegenden Arbeit besteht darin, die psychologischen Faktoren zukünftiger vernetzter Kollisionswarnungen zu verstehen. Ausgehend von der theoretischen Analyse relevanter psychologischer Theorien wurden wesentliche Implikationen und offene Fragestellungen abgeleitet. Zur Beantwortung dieser Fragen wurden drei Fahrsimulator- Studien durchgeführt, in denen der Einfluss von AR als Darstellungsprinzip auf die Effizienz begrenzt zuverlässiger Warnungen über sichtverdeckte Gefahren untersucht wurden. Um valide Aussagen über die längerfristige Wirksamkeit treffen zu können, wurden in den Versuchen sowohl notwendige als auch unnötige Warnungen betrachtet. Eine erste Studie mit 88 Teilnehmern untersuchte den Mehrwert prototypischer AR-Warnungen unterschiedlicher Modalität (visuell vs. auditiv) gegenüber unspezifischen Warnungen. Visuelle AR-Warnungen zeigten klare Vorteile bezüglich Blick- und Bremsreaktionen, Geschwindigkeiten, Kollisionszahlen und subjektiven Bewertungen. Auditive AR-Warnungen hingegen führten zu einzelnen positiven, jedoch auch einigen negativen Effekten. In der zweiten Studie mit 80 Teilnehmern wurden die Auswirkungen gestalterischer Teilaspekte visueller AR-Warnungen verglichen. Das Hinzufügen von spezifischen Warnsymbolen über Bewegungsrichtung und Typ der Gefahr oder einer Vergrößerungs-Animation mit gleicher zeitlicher Veränderung wie bei der AR-Warnung führte zu einzelnen positiven aber nicht konsistenten Effekten. Im Gegensatz dazu führten räumlich verortete AR-Warnungen erneut sowohl zu schnelleren und stärkeren Fahrerreaktionen als auch zu besseren subjektiven Bewertungen. In der dritten Studie mit 36 Teilnehmern wurden schließlich die individuellen Effekte der räumlichen Information an sich und der Codierung dieser Information mittels AR analysiert. Dazu wurden Warnungen ohne Information über die Position der Gefahr, mit symbolisch kodierter Information, sowie mit AR-kodierter Information verglichen. Der höhere Informationsgehalt führte zu durchgehend stärkeren Bremsungen, höherem Systemvertrauen und besseren subjektiven Bewertungen. Darüber hinaus ermöglichte die AR-Kodierung desselben Informationsgehalts der Warnungen sowohl schnellere Gefahrenentdeckung als auch kürzere Bremsreaktionszeiten. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit einen deutlichen Mehrwert von spezifischen Informationen bei Warnungen vor sichtverdeckten Gefahren sowie das hohe Potenzial von AR als Darstellungsprinzip, insbesondere für Warnungen zukünftiger Kollisionsvermeidungssysteme. Die systematische Analyse der bei der Gestaltung von Warnungen relevanten psychologischen Faktoren sowie unsere empirischen Erkenntnisse zu deren relativen Einfluss auf das Nutzerverhalten können zudem auf Warnungen anderer Anwendungen und Domänen übertragen werden, und somit einen generellen Beitrag zur Vermeidung von Unfällen in Mensch-Maschine-Systemen liefern.

Future connected vehicles will be able to warn about hidden dangers already before they are visible for the driver. With sight obstructions as one of the most common factors of accident causation, there is a huge potential to improve traffic safety. However, it is unclear how to design the human-machine-interface of such systems to effectively warn drivers about invisible dangers. Especially the expectation that such warnings will be comparably unreliable lead to conflicting demands on amount and coding of warning information. Earlier work shows that warnings that contain more specific information about a hazard can improve drivers understanding of and responses to warnings but they can also raise processing costs and delay reactions or even distract drivers. Psychological theories as well as related research indicates that augmented reality (AR) has the potential to improve warning effectiveness through optimized coding of additional information. AR warnings can inherently transmit the location of a hazard and – due to the corresponding approach of the referenced display towards the driver – could increases the salience of a warning. The general aim of this work is to understand the human factors of future communication-based collision warnings. Based on a theoretical analysis revealing the most relevant questions within that context, we conducted three driving simulator studies to understand the impact of AR warning design on the effectiveness of unreliable warnings about sight obstructed dangers. To consider not only short-term effectiveness, all studies contained several necessary as well as unnecessary warnings that were analyzed in detail. The first study with 88 participants investigated the benefit of prototypical AR warnings over unspecific warnings of different modalities (visual vs. auditory). Visual AR warnings showed advantages over the other warning designs in gaze and brake reaction times, passing speeds, collision rates and subjective evaluation. Auditory AR warnings did not reveal comparable effects. The second test with 80 participants examined the contribution of different design aspects of visual AR warnings. Adding specific warning symbols or scaling animations to the warnings showed some positive but rather inconsistent effects. In contrast, spatial referencing even of an unspecific warning symbol with AR consistently improved driver’s reactions and evaluations. A third experiment with 36 participants observed the differential effects of the spatial information per se and the coding of the information with AR. The warnings had either no spatial information, symbolically encrypted spatial information or AR encrypted spatial information. A higher amount of information consistently led to stronger brake reactions, higher trust and better subjective evaluation. Additionally, with AR encryption we observed faster fixations as well as brake reactions. The present research emphasizes the importance of specificity for warnings about hidden hazards and the potential of AR especially for in-vehicle warnings of future collision avoidance systems. The systematic analysis of psychological factors of warning design and the corresponding findings on their relative contribution to driver’s behavior might also be transferred to other domains and applications of warning and information design. / In naher Zukunft werden vernetzte Fahrzeuge bereits vor sichtverdeckten Gefahren warnen können, noch bevor diese für den Fahrer sichtbar sind. Da Sichtverdeckungen bei einem Großteil schwerer Verkehrsunfälle eine Rolle spielen, stellt dies ein großes Potenzial zur Erhöhung der Verkehrssicherheit dar. Unklar ist jedoch, wie die Mensch-Maschine- Schnittstelle solcher Systeme gestaltet werden sollte, um Autofahrer möglichst effektiv vor noch nicht sichtbaren Gefahren zu warnen. Insbesondere die Vorhersage, dass solche Systeme nur eine begrenzte Zuverlässigkeit haben werden, führt zu teilweise widersprüchlichen Anforderungen an Informationsmenge und Kodierung der Warnungen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Warnungen mit spezifischen Informationen über eine Gefahr einerseits Verständnis und Reaktionen der Fahrer auf die Warnungen verbessern, andererseits aber auch kognitiven Verarbeitungsaufwand und Reaktionszeiten erhöhen und ablenken können. Sowohl kognitionspsychologische Theorien als auch Studien aus unserem Forschungsgebiet deuten darauf hin, dass die Darstellungsprinzipien der erweiterten Realität (AR, für engl. augmented reality) das Potenzial bieten, die Effizienz solcher Warnungen durch eine optimierte Kodierung von Zusatzinformationen zu steigern. AR-Warnungen können inhärent die Position einer Gefahr übermitteln, ohne dass der Fahrer dazu eine abstrakte Repräsentation der Information auf die reale Umwelt übertragen muss. Das grundlegende Ziel der vorliegenden Arbeit besteht darin, die psychologischen Faktoren zukünftiger vernetzter Kollisionswarnungen zu verstehen. Ausgehend von der theoretischen Analyse relevanter psychologischer Theorien wurden wesentliche Implikationen und offene Fragestellungen abgeleitet. Zur Beantwortung dieser Fragen wurden drei Fahrsimulator- Studien durchgeführt, in denen der Einfluss von AR als Darstellungsprinzip auf die Effizienz begrenzt zuverlässiger Warnungen über sichtverdeckte Gefahren untersucht wurden. Um valide Aussagen über die längerfristige Wirksamkeit treffen zu können, wurden in den Versuchen sowohl notwendige als auch unnötige Warnungen betrachtet. Eine erste Studie mit 88 Teilnehmern untersuchte den Mehrwert prototypischer AR-Warnungen unterschiedlicher Modalität (visuell vs. auditiv) gegenüber unspezifischen Warnungen. Visuelle AR-Warnungen zeigten klare Vorteile bezüglich Blick- und Bremsreaktionen, Geschwindigkeiten, Kollisionszahlen und subjektiven Bewertungen. Auditive AR-Warnungen hingegen führten zu einzelnen positiven, jedoch auch einigen negativen Effekten. In der zweiten Studie mit 80 Teilnehmern wurden die Auswirkungen gestalterischer Teilaspekte visueller AR-Warnungen verglichen. Das Hinzufügen von spezifischen Warnsymbolen über Bewegungsrichtung und Typ der Gefahr oder einer Vergrößerungs-Animation mit gleicher zeitlicher Veränderung wie bei der AR-Warnung führte zu einzelnen positiven aber nicht konsistenten Effekten. Im Gegensatz dazu führten räumlich verortete AR-Warnungen erneut sowohl zu schnelleren und stärkeren Fahrerreaktionen als auch zu besseren subjektiven Bewertungen. In der dritten Studie mit 36 Teilnehmern wurden schließlich die individuellen Effekte der räumlichen Information an sich und der Codierung dieser Information mittels AR analysiert. Dazu wurden Warnungen ohne Information über die Position der Gefahr, mit symbolisch kodierter Information, sowie mit AR-kodierter Information verglichen. Der höhere Informationsgehalt führte zu durchgehend stärkeren Bremsungen, höherem Systemvertrauen und besseren subjektiven Bewertungen. Darüber hinaus ermöglichte die AR-Kodierung desselben Informationsgehalts der Warnungen sowohl schnellere Gefahrenentdeckung als auch kürzere Bremsreaktionszeiten. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit einen deutlichen Mehrwert von spezifischen Informationen bei Warnungen vor sichtverdeckten Gefahren sowie das hohe Potenzial von AR als Darstellungsprinzip, insbesondere für Warnungen zukünftiger Kollisionsvermeidungssysteme. Die systematische Analyse der bei der Gestaltung von Warnungen relevanten psychologischen Faktoren sowie unsere empirischen Erkenntnisse zu deren relativen Einfluss auf das Nutzerverhalten können zudem auf Warnungen anderer Anwendungen und Domänen übertragen werden, und somit einen generellen Beitrag zur Vermeidung von Unfällen in Mensch-Maschine-Systemen liefern.

CRISPR-Cas ist ein adaptives Immunsystem, dass Bakterien und Archaeen vor eindringenden Nukleinsäuren schützt. Es besteht aus einem sogenannten CRISPR-Array, der als genetisches Gedächtnis vorangegangene Infektionen speichert und einem cas Lokus, welcher für die Abwehr essentielle Proteine codiert. Das CRISPR-assoziierte Protein 9 (Cas9) des Typ II CRISPR-Cas Systems aus Streptococcus pyogenes ist heutzutage das Mittel der Wahl für Gentherapie und Genom-Modifikationen. Allerdings gibt es nach wie vor Probleme mit der Ungenauigkeit dieses Systems, welche für eben genannte Ansätze behoben werden müssen. Aus diesem Grund ist es besonders wichtig zu verstehen, in welcher Weise die Spezifität von Cas9 beeinflusst wird. In dieser Arbeit wurden die Voraussetzungen für eine spezifische Erkennung der Zielsequenz durch drei verschiedene Cas9 Proteine des Typs II-A und ein Cas12a Protein des Typs V-A CRISPR-Cas Systems untersucht. Wir zeigen, dass Arginin Seitenketten der sogenannten „bridge“ Helix in Cas9 von S. pyogenes eine wichtige Rolle in der Bindung und Spaltung der DNS spielen. Diese Seitenketten können in zwei Gruppen unterteilt werden, welche die Spezifität von Cas9 entweder vergrößern oder verkleinern. Die Aminosäuren R63 und R66 reduzieren die Spezifität von Cas9 indem sie den sogenannten R-loop in Anwesenheit einer Fehlpaarung stabilisieren. Wir zeigen außerdem, dass Q768 eine erhöhte Toleranz von Cas9 zu Fehlpaarungen an Position 15 der Zielsequenz vermittelt und dass das Entfernen dieser Aminosäure die Spezifität von Cas9 im Bereich der Zielsequenz, die am weitesten von der PAM entfernt ist, erhöht. Eine Kombination der Mutationen der oben genannten Arginin und Glutamin Seitenketten führt zur Erhöhung der Gesamtspezifität von Cas9. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zum Verständnis bei, wie Cas9 Fehlpaarungen innerhalb der Zielsequenz detektiert und können dabei helfen weitere Strategien für eine verbesserte Spezifität von Cas9 zu entwickeln. / CRISPR-Cas (CRISPR-associated) systems are adaptive immune systems that have evolved in bacteria and archaea for protection against invading nucleic acids. They consist of a CRISPR array, where the genetic memory of the infection is stored and ultimately transcribed and processed into CRISPR RNAs (crRNAs), and of an operon of cas genes that encodes the Cas proteins. This thesis is focused on class 2 CRISPR-Cas systems that employ single RNA-guided nucleases in the interference phase. Dual-RNA guided CRISPR-associated protein 9 (Cas9) of the type II CRISPR-Cas system has become the tool of choice for genome editing applications in life sciences. However, off-target cleavage by Cas9 is one major issue that needs to be addressed for applications of the CRISPR-Cas9 technology for therapeutic purposes. Therefore, understanding the features that govern Cas9 specificity is of great importance. In this thesis, seed sequence requirements of three Cas9 proteins from the class 2 type II-A and one Cas12a protein from the class 2 type V-A CRISPR-Cas system have been investigated. We analyze the influence of mismatches and show that they affect target binding and/or cleavage by S. pyogenes Cas9. Additionally, we demonstrate that the arginine residues from the bridge helix of S. pyogenes Cas9 are important for target DNA binding and cleavage. Furthermore, these residues comprise two groups that either increase or decrease Cas9 sensitivity to mismatches i.e. specificity. R63 and R66 reduce Cas9 specificity by stabilizing the R-loop in the presence of mismatches. We also show that Q768 mediates Cas9 tolerance to a mismatch at target position 15 and removal of Q768 increases Cas9 specificity in the PAM-distal part of the target. Combination of arginine mutations and Q768A increased overall the sensitivity to mismatches. The results of this thesis elucidate how Cas9 senses PAM-adjacent mismatches and provide a basis to develop strategies for Cas9 variants with enhanced specificity.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Leistungsfähigkeit der Hochleistungsflüssigchromatographie mit Photodiodenarraydetektion (HPLC-DAD) im Rahmen der Systematischen Toxikologischen Analyse (STA) umfassend untersucht, ein besonderer Schwerpunkt lag dabei auf der Aussagesicherheit bei der Substanzidentifizierung. Die Grundlage für diese Untersuchungen bildete die Messung der UV-Spektren und relativen Retentionszeiten (RRT) von 2.682 toxikologisch relevanten Substanzen mit Hilfe moderner Diodenarraydetektoren und unter einheitlichen experimentellen Bedingungen (Eluent: Acetonitril/ Phosphatpuffer pH 2,3; Trennsäule: Lichrospher RP8ec). Die erhaltenen Daten wurden zusammen mit weiteren Substanzinformationen in einer Spektrenbibliothek zusammengefasst, die als Buch und CD-ROM auch der Öffentlichkeit zugänglich gemacht wurde. Bei der Entwicklung eines Konzeptes zur Methodenvalidierung für die STA erwiesen sich insbesondere die Kenngrößen Selektivität und Spezifität als von zentraler Bedeutung. Unter Verwendung eines Fensteransatzes für die RRT und des Similarity Index (SI) für den Spektrenvergleich wurden sämtliche möglichen Substanzpaare aus der Spektrenbibliothek miteinander auf ihre Unterscheidbarkeit hin verglichen, wobei verschiedene RRT-Fensterbreiten und SI-Schwellenwerte zugrundegelegt wurden. Aus den Ergebnissen wurden Selektivitätsparameter wie die Relative Identification Power (RIP), die Discriminating Power (DP) und die Mean List Length (MLL) berechnet. Mit einer RIP von 84,2 %, einer MLL von 1,25 und einer DP von 0,9999 wurden für die Substanzidentifikation anhand von RRT + UV-Spektrum im Literaturvergleich sehr gute Ergebnisse erhalten. Die hohe Grad an Spezifität der UV-Spektren für den Einsatz in der STA wurde einerseits durch Auszählung sämtlicher in der Spektrenbibliothek gefundener Chromophore/Absorptionssysteme belegt: 1.650 verschiedene Absorptionssysteme wurden gefunden, über 60 % der Verbindungen trugen ein in diesem Substanzbestand einzigartiges Absorptionssystem. Andererseits wurde die computergestützte Unterscheidbarkeit zwischen verschiedenen Gruppen jeweils strukturell ähnlicher Wirkstoffe anhand des UV-Spektrums untersucht. Hierfür wurden 487 Substanzen in ein hierarchisches System von Haupt- und Untergruppen eingeteilt, zwischen denen anschließend mit Hilfe der Schrittweisen Diskriminanzanalyse (SDA) unterschieden werden sollte. Die sehr guten Klassifizierungsergebnisse und die Auflösung auch feiner struktureller Unterschiede, oftmals abseits des eigentlichen Absorptionssystems, lassen es grundsätzlich möglich erscheinen, auch Substanzen für die STA zu erschließen, die nicht in der Spektrenbibliothek enthalten sind. Insgesamt erwies sich die HPLC-DAD als hochselektives und -spezifisches Messverfahren, das zu Recht eine der wichtigsten STA-Methoden darstellt. / In this thesis the capability of high-performance liquid chromatography with photodiode array detection in the context of Systematical Toxicological Analysis (STA) was extensively investigated with a special focus on the certainty of substance identification. As the foundation for these investigations, UV spectra and relative retention times (RRT) of 2,682 toxicologically relevant compounds were recorded under uniform experimental conditions (mobile phase: acetonitrile/ phosphate buffer pH 2.3; column: Lichrospher RP8ec) using up-to-date photodiode array detectors. Together with additional substance information these data were built into a spectra library also made available to the public in the form of a book and a CD-ROM. During the development of a concept for the validation of a STA method, selectivity and specificity were found to be of central importance. Using a window approach for the RRT and the Similarity Index (SI) for spectral comparison, all possible substance pairs within the spectra library were examined in terms of their respective distinguishability, based on different RRT windows and SI threshold values. From the results selectivity parameters such as the Relative Identification Power (RIP), the Discriminating Power (DP), and the Mean List Length (MLL) were calculated. As compared to the literature, with a RIP of 84.2 %, a MLL of 1.25, and a DP of 0,9999 excellent results were obtained for the substance identification based on the combination of RRT and UV spectrum. The high degree of specificty of UV spectra for use in the STA was demonstrated on the one hand by counting all different chromophores/ absorption systems found in the spectra library: 1,650 systems were found, more than 60 % of the substances bore absorption systems unique in the dataset. On the other hand the computer-based distinction between different groups of structurally similar compounds on the basis of the UV spectrum was investigated by dividing 487 substances into a hierarchical system of main and subgroups and trying to distinguish between these groups using stepwise discriminant analysis (SDA). The highly satisfying classification results together with the resolution of fine structural differences, often remote from the actual absorption system, make it seem possible to also render substances not included in the spectra library accessible for the STA. In conclusion HPLC-DAD proved to be highly selective and specific, rightfully regarded as one of the most important STA methods.

In der Lebensmittelindustrie steht die Entwicklung neuer innovativer Produkte im Vordergrund. Insbesondere die Modifizierung von Proteinen durch den Einsatz des Enzyms mikrobielle Transglutaminase (mTG) bietet hier neue Ansatzpunkte. Das Enzym verknüpft die γ-Carboxamidgruppe proteingebundenen Glutamins mit der ε-Aminogruppe von Lysin unter Bildung sogenannter Isopeptidbindungen. Durch diese Reaktion erreicht man eine gezielte Veränderung funktioneller Eigenschaften der Proteine wie z.B. Gelbildung, Löslichkeit, Wasserbindevermögen, Emulgier- und Schäumungsverhalten. Im Rahmen der Arbeit wurden grundlegende Forschungen zur Aufklärung des Mechanismus der mTG-katalysierten Proteinquervernetzungsreaktion im Hinblick auf das Lebensmittel Milch durchgeführt. Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit dem Ablauf der mTG-katalysierten Reaktion innerhalb der Caseinmicellen und dessen Effekt auf die Micellstruktur. Es zeigte sich, dass durch mTG die Caseine in der micellaren Struktur fixiert werden und der extramicellare Caseinanteil abnimmt. Hierbei wird β-Casein stärker vernetzt als αs-Casein. Infolge dieser intramicellaren Caseinquervernetzung wird die Stabilität der micellaren Struktur sowohl gegenüber destabilisierenden Reagenzien (EDTA, Ethanol, GDL), mechanischen Parametern (Hochdruck) sowie einer enzymatischen Proteolyse (Chymotrypsin, Pepsin) signifikant verbessert. Vermutlich werden die Isopeptide hierfür netzartig vorwiegend zwischen den β-Caseinen in der äußeren Micellschicht ausgebildet. Im zweiten Teil der Arbeit stand die Identifizierung der Reaktionsorte, d.h. die an der enzymatischen Vernetzung beteiligten Gln- und Lys-Reste, im Vordergrund, um den Einfluss der Proteinstruktur auf die Spezifität der mTG zu erfassen. Bei der Bestimmung der Reaktionsorte für β-Casein konnten 5 der 21 Gln-Reste und 3 der 11 Lys-Reste als zugänglich für mTG eingestuft werden. Für β-Lactoglobulin konnten unter Normaldruck 3 der 15 Lys-Reste aber keine Gln-Reste durch das Enzym markiert werden. Unter Hochdruck bei 400 MPa wurden 4 der 9 Gln-Reste sowie zwei weitere Lys-Reste als mTG-reaktiv nachgewiesen. Die Lage dieser Reaktionsorte im Protein zeigte, dass Gln-Reste bevorzugt durch mTG modifiziert werden, welche in hydrophoben Proteinabschnitten lokalisiert sind und große hydrophobe Aminosäuren N-seitig sowie positiv geladene Aminosäuren C-seitig aufweisen. Die Lys-Reste werden nur durch mTG angegriffen, wenn diese neben Aminosäuren mit ungeladenen bzw. positiv geladenen Seitenketten lokalisiert sind, während die Nachbarschaft zu negativ geladenen Aminosäuren sowie zu Aminosäuren mit ungeladenen polaren (hydrophilen) Seitenketten die Angreifbarkeit verhindert. Weiterhin zeigte eine Bestimmung der reaktiven Gln- und Lys-Reste im β-Casein innerhalb der Caseinmicelle, dass die Zugänglichkeit für mTG durch die Micellstruktur deutlich vermindert ist. Es wird vermutet, dass in der Caseinmicelle eine Art Vorstrukturierung der β-Caseine existiert. Abschließend wurden die Ergebnisse für einen Vorschlag eines Micellmodells herangezogen. Das im Rahmen der Arbeit vorgeschlagene Micellmodell beruht auf dem Internal Structure Modell, im speziellen auf dem „dual bonding model“ nach Horne, welches weiter charakterisiert werden konnte. So wird vermutet, dass β-Casein hauptsächlich im äußeren Micellbereich lokalisiert ist, während sich die αs-Caseine eher im Micellinneren befinden. β-Casein ist hierbei in laminaren Schichten angeordnet, wobei die hydrophilen Köpfe den größtmöglichen Abstand zueinander haben und hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den hydrophoben Schwänzen ausgebildet werden können. Wird die Micelle nun mit mTG behandelt, so kann ausgehend von diesem Modell die quervernetzte Caseinmicelle als „GiOTTO® -Modell“ dargestellt werden. Dieses ist aus einem „festen äußeren Mantel“ aus quervernetzten β-Caseinen (Isopeptidnetzwerk) und einem „weichen Kern“ aus nur gering vernetzten αs-Caseinen zusammengesetzt.

In der Lebensmittelindustrie steht die Entwicklung neuer innovativer Produkte im Vordergrund. Insbesondere die Modifizierung von Proteinen durch den Einsatz des Enzyms mikrobielle Transglutaminase (mTG) bietet hier neue Ansatzpunkte. Das Enzym verknüpft die γ-Carboxamidgruppe proteingebundenen Glutamins mit der ε-Aminogruppe von Lysin unter Bildung sogenannter Isopeptidbindungen. Durch diese Reaktion erreicht man eine gezielte Veränderung funktioneller Eigenschaften der Proteine wie z.B. Gelbildung, Löslichkeit, Wasserbindevermögen, Emulgier- und Schäumungsverhalten. Im Rahmen der Arbeit wurden grundlegende Forschungen zur Aufklärung des Mechanismus der mTG-katalysierten Proteinquervernetzungsreaktion im Hinblick auf das Lebensmittel Milch durchgeführt. Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit dem Ablauf der mTG-katalysierten Reaktion innerhalb der Caseinmicellen und dessen Effekt auf die Micellstruktur. Es zeigte sich, dass durch mTG die Caseine in der micellaren Struktur fixiert werden und der extramicellare Caseinanteil abnimmt. Hierbei wird β-Casein stärker vernetzt als αs-Casein. Infolge dieser intramicellaren Caseinquervernetzung wird die Stabilität der micellaren Struktur sowohl gegenüber destabilisierenden Reagenzien (EDTA, Ethanol, GDL), mechanischen Parametern (Hochdruck) sowie einer enzymatischen Proteolyse (Chymotrypsin, Pepsin) signifikant verbessert. Vermutlich werden die Isopeptide hierfür netzartig vorwiegend zwischen den β-Caseinen in der äußeren Micellschicht ausgebildet. Im zweiten Teil der Arbeit stand die Identifizierung der Reaktionsorte, d.h. die an der enzymatischen Vernetzung beteiligten Gln- und Lys-Reste, im Vordergrund, um den Einfluss der Proteinstruktur auf die Spezifität der mTG zu erfassen. Bei der Bestimmung der Reaktionsorte für β-Casein konnten 5 der 21 Gln-Reste und 3 der 11 Lys-Reste als zugänglich für mTG eingestuft werden. Für β-Lactoglobulin konnten unter Normaldruck 3 der 15 Lys-Reste aber keine Gln-Reste durch das Enzym markiert werden. Unter Hochdruck bei 400 MPa wurden 4 der 9 Gln-Reste sowie zwei weitere Lys-Reste als mTG-reaktiv nachgewiesen. Die Lage dieser Reaktionsorte im Protein zeigte, dass Gln-Reste bevorzugt durch mTG modifiziert werden, welche in hydrophoben Proteinabschnitten lokalisiert sind und große hydrophobe Aminosäuren N-seitig sowie positiv geladene Aminosäuren C-seitig aufweisen. Die Lys-Reste werden nur durch mTG angegriffen, wenn diese neben Aminosäuren mit ungeladenen bzw. positiv geladenen Seitenketten lokalisiert sind, während die Nachbarschaft zu negativ geladenen Aminosäuren sowie zu Aminosäuren mit ungeladenen polaren (hydrophilen) Seitenketten die Angreifbarkeit verhindert. Weiterhin zeigte eine Bestimmung der reaktiven Gln- und Lys-Reste im β-Casein innerhalb der Caseinmicelle, dass die Zugänglichkeit für mTG durch die Micellstruktur deutlich vermindert ist. Es wird vermutet, dass in der Caseinmicelle eine Art Vorstrukturierung der β-Caseine existiert. Abschließend wurden die Ergebnisse für einen Vorschlag eines Micellmodells herangezogen. Das im Rahmen der Arbeit vorgeschlagene Micellmodell beruht auf dem Internal Structure Modell, im speziellen auf dem „dual bonding model“ nach Horne, welches weiter charakterisiert werden konnte. So wird vermutet, dass β-Casein hauptsächlich im äußeren Micellbereich lokalisiert ist, während sich die αs-Caseine eher im Micellinneren befinden. β-Casein ist hierbei in laminaren Schichten angeordnet, wobei die hydrophilen Köpfe den größtmöglichen Abstand zueinander haben und hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den hydrophoben Schwänzen ausgebildet werden können. Wird die Micelle nun mit mTG behandelt, so kann ausgehend von diesem Modell die quervernetzte Caseinmicelle als „GiOTTO® -Modell“ dargestellt werden. Dieses ist aus einem „festen äußeren Mantel“ aus quervernetzten β-Caseinen (Isopeptidnetzwerk) und einem „weichen Kern“ aus nur gering vernetzten αs-Caseinen zusammengesetzt.

Exekutive Funktionen (EF) sind eine Gruppe von Top-Down-Prozessen, die in neuartigen Situationen eingesetzt werden, um neue Trigger-Response-Assoziationen herzustellen oder vorhandene Handlungsoptionen an neue Situationen anzupassen. Obwohl EF erschöpfend untersucht wurden, bleiben wichtige Fragen offen. Beispiele dafür sind (a) Sind Exekutivfunktionen vollständig trennbar oder beruhen sie auf einem gemeinsamen neurokognitiven System? (b) Was messen verschiedene Versionen der Stroop-Aufgabe, einer der meist-verwendeten Aufgaben zur Prüfung der Inhibitionsfunktion? (c) Muss Inhibition immer Ressourcen-fordernd sein, oder gibt es eine Form der Inhibition, die mühelos implementiert werden kann? Zur Beantwortung dieser Fragen, habe ich neurokognitive Korrelate von EF und ihrer Verbesserung mithilfe posthypnotischer Suggestionen (PHS) und Ereigniskorrelierter Hirnpotentiale (EKP) untersucht. Zusammenfassend ergaben sich folgende Antworten: (a) Psychometrische und EKP-Daten aus den Studien zur Gedächtnisaktualisierung und Inhibition sowie deren Verbesserung anhand PHS zeigten sowohl funktionsspezifische als auch gemeinsame neurokognitive Prozesse der Inhibition und Aktualisierung. (b) Obwohl sowohl die vokale als auch die manuelle Version der Stroop-Aufgabe Inhibitionsfunktionen erfordern, ist die vokale Version Ressourcen-fordernder, da sie mindestens einen zusätzlichen Lokus der Interferenz im Antwort-Produktionsprozess aufweist, der nicht mit PHS beeinflussbar ist und der in der manuellen Version fehlt. (c) Unter Verwendung PHS zur Erhöhung der Präferenzen für kalorienarme Lebensmittel untersuchte ich die Auflösung von Konflikten. Die EKP-Ergebnisse zeigten, dass auch Konflikt-Auflösung, ähnlich wie Inhibition, Ressourcen konsumiert. Insgesamt zeigt dieses Projekt, dass die Verwendung Aufgaben-bezogener PHS in Kombination mit Neuroimaging-Techniken einen fruchtbaren Ansatz für die Untersuchung ungeklärter Fragen über Exekutivfunktionen darstellt. / Executive functions (EF) are a group of top-down processes used in novel situations to develop or adapt existing responses to the task at hand. Even though EFs are studied exhaustively, several important questions remain unanswered: (a) Are EFs entirely separated, or do they rely on a common system? (b) What do different versions of the Stroop task measure? (c) Does inhibition always need to be effortful? To address these questions, I investigated neurocognitive correlates of EFs and their enhancements by means of posthypnotic suggestions (PHS) and event-related potentials (ERP). However, before one can use PHSs, it must be elucidated whether and how they affect EFs. Although PHSs are used repeatedly for improving inhibition, it is unclear whether their effects are mediated by bottom-up or top-down processes. By using an updating task, I showed that effects of PHSs can be attributed to top-down processes. Accordingly, a new theory of hypnosis was proposed and empirically tested by modeling hypnotizability scores with structural equation modeling. In short, the simulation-adaption theory suggests that several top-down processes are employed for responding to suggestions. After elucidating the driving mechanism of PHSs is mentally practicing a novel strategy, PHSs were used for addressing the questions regarding EFs. Summarizing (a) the psychometric and ERP results from several studies indicated that different EFs rely on both function-specific and shared neurocognitive processes. (b) Even though different versions of the Stroop task are tapping into inhibition, the vocal compared to the manual version has at least an extra response-production-related locus of interference. (c) Using PHSs for increasing preferences for low-calorie food items, it is shown that resolve is effortful to implement, as indicated by increased P300 amplitudes. Together, this project shows how PHSs, along with neuroimaging techniques, can provide a novel approach for investigating EFs.